2018-08-14
蔗糖是植物中運輸的糖，很容易被昆蟲吸收以滿足生理代謝的需要。 BmSuc1是一種新型動物β-呋喃果糖苷酶（β-FFase，EC 3.2.1.26）編碼基因，首先在家蠶Bombyx mori中克隆和鑒定。推測BmSuc1通過有效水解從桑葉中吸收的蔗糖在家蠶-桑椹酶適應系統中發揮重要作用，但尚未被證明。在本文中，作者提供了家蠶β-FFase的功能分析。研究發現蔗糖酶活性主要依賴于β-FFase而不是α-葡萄糖苷酶來水解蔗糖并產生葡萄糖和果糖用于家蠶的發育。使用針對BmSuc1的短發夾RNA（shRNA）介導的RNAi系統，發現幼蟲中腸中蔗糖水解的能力顯著降低，并觀察到異常表型，例如體積較小，重量較輕和發育遲緩。脂肪體中糖原儲存顯著減少。這些結果表明BmSuc1在家蠶的糖代謝中作為必需的β-FFase。
RNA-seq材料：兩組樣本，WT和RNAi-BmSuc1
測序平臺：Illumina
1．BmSuc1的表達譜
為了確定BmSuc1的階段和組織特異性表達譜，通過RT-PCR和qRT-PCR研究了家蠶各階段不同組織中的mRNA水平。BmSuc1在整個幼蟲發育過程中表達，并且在5齡幼蟲中觀察到最大表達（圖1A和B）。在組織中，BmSuc1在中腸和絲腺的前部和中部表達。在其他組織中未檢測到BmSuc1 mRNA，包括脂肪體，頭部和馬氏小管（圖1C和D）。 這些結果與先前報道的一致，表明BmSuc1可能具有幼蟲消化和絲腺發育的功能。
圖1 BmSuc1在家蠶中的表達
2．BmSUC1在蔗糖水解中的基本功能
蔗糖及其他糖的酶活性檢測結果表明，家蠶β-FFase（即BmSuc1）具有水解和轉葡萄糖基化活性，且家蠶中蔗糖的水解主要取決于β-FFase的活性而不依賴于α-葡萄糖苷酶，而BmSuc1顯示出典型的β-FFase特征。
3．shRNA介導的BmSuc1 RNAi
實驗構建了五個BmSuc1-PXL-U6-shRNA重組質粒并轉染BmN細胞系以評估每種shRNA的效率。siRNA2抑制BmSuc1的轉錄53％和蔗糖水解活性34％，因此被用于進一步分析。通過紅色熒光的存在鑒定G1代中的陽性轉基因卵（圖2A）。此外，DsRed2在整個幼體（圖2B）和幼蟲脂肪體（圖2C），中腸（圖2D），前部絲腺（圖2E）和中部絲腺（圖2F）中表達強烈。選擇兩個獨立的轉基因家蠶品系，qRT-PCR和蛋白質印跡分析的結果表明，在轉基因家蠶幼蟲中，BmSuc1的表達在轉錄水平上和蛋白質水平上顯著下調（圖3）。
圖2用紅色熒光標記篩選RNAi - BmSuc1轉基因家蠶
圖3 qRT-PCR和western blot檢測轉基因家蠶中BmSuc1的沉默效果
4. RNAi-BmSuc1轉基因系中的異常表型
通過記錄所有齡期的幼蟲體重，發現三齡幼蟲的發育率存在明顯差異；表達RNAi-BmSuc1的轉基因個體的重量顯著低于WT（圖4A）。與WT相比，RNAi-BmSuc1幼蟲的體尺一般也較小（圖4B）。BmSuc1的敲除通過減小體重對家蠶幼蟲的發育產生負面影響，其主要原因可能與減少脂肪體量有關。
圖4 BmSuc1敲除后幼蟲發育及異常表型
5. BmSuc1敲低后糖代謝的變化
為了表征BmSuc1敲低對家蠶幼蟲糖分布的影響，作者分析了幼蟲中腸(A)、血淋巴(B)、脂肪體(C)中主要二糖酶活性的變化（圖5）。
圖5 BmSuc1敲除后幼蟲中腸(A)、血淋巴(B)、脂肪體(C)糖代謝變異模式
6. 轉錄組分析和糖代謝相關基因的轉錄分析
為獲得關于家蠶總體糖代謝調節的更多信息，在第3天第5齡 RNAi-BmSuc1轉基因系和WT幼蟲中進行了中腸的轉錄組分析。總共在RNAi-BmSuc1系中發現了202個差異基因，包括162個上調基因和40個下調基因。通過GO分類和通過KEGG分析的DEGs作圖的初步分析顯示，大量的GO術語與糖代謝強烈相關，例如葡萄糖，己糖和碳水化合物代謝（圖6）。這些結果表明，BmSuc1沉默導致中腸中糖代謝相關術語和基因的大規模改變。
圖6 與糖代謝相關的GO分析
參考文獻：
Q Gan et al. ?Biochim Biophys Acta (2018)
BmSUC1 Is Essential for Glycometabolism Modulation in the Silkworm, Bombyx Mori.
影響因子：5.108
轉錄調控事業部 王慧敏
2018年8月14日
