2018-06-26
LncRNAs在心血管發育和心血管疾病的發生發展過程中起著重要的作用，參與了細胞增殖、肥大和凋亡等過程，與動脈粥樣硬化、心肌梗死、心力衰竭等疾病密切相關。
目前尚未發現LncRNAs在擴張型心肌病（DCM）方面的研究報道。
近日，華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院李華萍老師所在課題組結合RNA-seq手段進行了DCM關聯病證的lncRNA挖掘，以期尋找新的藥物作用靶點，結果發表在Cardiovascular Research（IF=5.878）。
隨著基因測序技術的應用，在心血管領域將有更多的特異性lncRNA被發現，其生理效應及病理機制將逐漸被揭示。
本期主角：RP11-544D21.2 and XLOC_014288?
[癥狀描述]充血性心力衰竭為主，氣短和水腫較常見
[疾病診斷]依據病史、臨床表現及心電圖等檢查
[疾病原因]病毒感染、細胞免疫、家族遺傳、特發性
[流行病學]以中年人居多，男多于女
本文研究思路概述
第一步：表達譜測序（實驗組vs對照組有139個lncRNAs上調，174個lncRNAs下調）
第二步：qPCR驗證（TOP40差異lncRNAs中篩選出8個表達趨勢一致的lncRNAs）
第三步：假陽性篩查（通過不同數據庫功能交叉驗證，最終得到4個可信的lncRNAs）
第四步：RNA-seq（對目標lncRNAs進行siRNA干擾，阻斷其表達，進行轉錄組測序）
Figure 1：實驗方案設計
Part1 表達譜測序結果分析
樣本分組：
Control：10例健康志愿者組織樣本
Case：14例擴張型心肌病病人組織樣本
Table 1：測序樣本概況
對實驗組和對照組表達譜數據進行挖掘，根據p<0.05且|log2foldchange|>1的差異基因篩選標準，得到139個上調lncRNAs，174個下調lncRNAs；為了尋找跟表型關聯緊密的差異lncRNAs，我們又從中篩選出TOP20的上下調lncRNAs，作為后續驗證、尋找關鍵lncRNA的候選對象。
經過NONCODE database數據庫篩查，其中有10個被認為是心臟功能性相關的lncRNAs，隨后對其進行qPCR驗證，由Figure 2D可知，驗證結果顯示一致性良好。
Figure 2：LncRNA profile in heart from 10 control and 14 DCM patients.
Part2 RNA-seq測序結果分析
前期準備
經過多數據庫交叉驗證，最終從驗證的差異lncRNAs中篩選得到可信的兩個：RP11-544D21.2和XLOC_014288，并分別在六種組織器官中進行表達水平檢測，選取U6 siRNA作為內參，由Figure 3AB可知，RP11-544D21.2和XLOC_014288在各器官中普遍都有表達。
進一步在人心肌成纖維細胞（HCF）、人心肌細胞（HCM）、人心臟微血管內皮細胞（HCMEC)中分別驗證RP11-544D21.2和XLOC_014288的表達情況，qPCR內參分別為COL1A1、TNT 、CD31，二者依舊顯現出寬泛的區域表達特征。
上述結果表明，RP11-544D21.2和XLOC_014288可能作為多功能性lncRNA在擴張型心肌病的病理過程中發揮作用。
Figure 3：Tissue and cell distribution of identified lncRNAs.Relative expression levels of lncRNAs in different tissues after normalization to U6.
正式實驗（兩種靶向lncRNA+三種細胞樣本）
Control：未經lncRNA Smart Silence處理的細胞樣本
Case：特異性lncRNA Smart Silencer分別處理后的細胞樣本
人心肌成纖維細胞（HCF）+人心肌細胞（HCM）+人心臟微血管內皮細胞（HCMEC)
由于單獨的siRNA無法實現lncRNA的有效阻斷，本實驗選取了由三種siRNAs和三種反義寡核苷酸組成的混合體作為lncRNA Smart Silencer實現目標lncRNA的表達阻斷。
對干擾后的細胞樣本進行RNA測序分析，并對每個樣本中TOP10的pathway進行差異基因富集分析，由Figure 4可見，RP11-544D21.2和XLOC_014288在不同樣本的不同代謝通路中發揮的功能也是多樣的。
Figure 4：Pathway analysis of lncRNAs in different cell types.
為了進一步探究RP11-544D21.2和XLOC_014288的功能多效性作用機制，利用TRANSFAC database數據庫進行了lncRNA轉錄調控因子的預測，并篩查得到一個跟DCM相關的轉錄因子TFIID， TFIID是II型RNA聚合酶復合物前體的一個組成單元，一般由TAFs家族因子組合而成。
對TAFs進行定量檢測發現，相較于對照組，TAF10 和 TAF1C在DCM樣本中表達量上調；TAF1L、TAF5和TAF11在DCM樣本中表達量顯著下調。
借由以上實驗數據，可以窺見TFIID在充血性心力衰竭患者體內表達的不平衡性。相關性表達分析數據則表明，TAF10與四個DCM樣本中上調表達的lncRNAs均呈現良好的正相關。后續的CHIP-PCR實驗也證實TAF10與RP11-544D21.2有特異性結合位點。
Figure 5：Transcription factor for differently expressed lncRNAs.
結語
隨著現代生物學技術尤其是高通量測序技術在治療心血管疾病研究中的應用，心血管疾病藥物證候相關的lncRNA標志物將被發現，lncRNA作為治療心血管疾病新的作用靶點也將被揭示。對闡明中藥治療心血管疾病的分子機制及新藥的開發將具有重要意義。
