最近，派森諾生物再次與山東大學(xué)合作，在《Bioresource Technology》（影響因子5.651）上發(fā)表文章，揭示厭氧氨氧化耦合反硝化（SAD）過程中，有機(jī)質(zhì)和粉末活性炭如何分別驅(qū)動(dòng)細(xì)菌菌群發(fā)生進(jìn)化。
1 研究背景
近期，富氮廢水受到了很多關(guān)注，因?yàn)樗鼭撛谕{著水生生態(tài)系統(tǒng)。厭氧氨氧化被認(rèn)為是一種去除廢水中氮的方法。這一原理過程是厭氧氨氧化細(xì)菌利用亞硝酸鹽作為電子受體，在無氧條件下直接將銨鹽轉(zhuǎn)化為氮?dú)狻栴}就是厭氧氨氧化細(xì)菌生長速度緩慢，一般細(xì)菌倍增時(shí)間達(dá)到11天，而在膜生物反應(yīng)器（MBR）中倍增時(shí)間縮短到了3天。雖然MBR有著明顯的優(yōu)勢(shì)，但是對(duì)其采用什么樣的控制方法和怎么減輕膜污染依然是個(gè)挑戰(zhàn)。
在傳統(tǒng)方法上，通過使用粉末活性炭減少膜表面上有機(jī)物和無機(jī)物的吸附來緩解膜污染。在SAD過程中，有機(jī)質(zhì)（OM）可以做為電子供體消耗亞硝酸鹽。盡管反硝化作用需要足夠的OM，但是廢水中有限的OM更有利于厭氧氨氧化，這可以避免受OM的抑制作用和外來碳源的高成本費(fèi)用的限制。目前，SAD過程中活性炭粉末（PAC）對(duì)微生物菌群的影響還是不清楚的，所以有必要對(duì)SAD過程中OM和PAC對(duì)菌群進(jìn)化的影響進(jìn)行研究。
本文研究目的是揭示SAD過程中，OM和PAC能直接驅(qū)動(dòng)反硝化作用的增強(qiáng)。主要目標(biāo)：1、在OM含量，有或者沒有PAC的條件下，對(duì)抗膜污染淹沒式厭氧膜生物反應(yīng)器（SAMBRs）中SAD過程進(jìn)行啟動(dòng)和評(píng)估；2、研究OM和PAC驅(qū)動(dòng)下SAMBRs中微生物菌群的變異；3、探究PAC對(duì)膜污染控制過程中的影響。
2 研究方法
測(cè)序技術(shù)：Illumina MiSeq平臺(tái)
測(cè)序模式：16S rRNA基因V4區(qū)
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：
3 研究結(jié)果
3.1 OM對(duì)厭氧氨氧化活性和EPS（胞外聚合物）含量的影響
在第12-30天，反應(yīng)器B流出的銨鹽和亞硝酸鹽持續(xù)減少，反應(yīng)器A表現(xiàn)出更好的除銨性能。在第30天，增加了銨鹽和亞硝酸鹽的流入，同時(shí)提高了反應(yīng)器B中OM的含量。發(fā)現(xiàn)反應(yīng)器A中硝酸鹽的流出濃度呈增加趨勢(shì)，說明獲得了厭氧氨氧化活性。對(duì)于反應(yīng)器B，銨鹽和亞硝酸鹽的流出顯著增加，OM濃度在第33天有了顯著的增加，結(jié)果說明厭氧氨氧化活性受到明顯抑制，特別是提高了OM濃度之后，趨勢(shì)更明顯。而當(dāng)減少OM的濃度時(shí)，減輕了對(duì)厭氧氨氧化的抑制，隨后流出的銨鹽和亞硝酸鹽也緩慢減少。
剛開始的時(shí)候，兩個(gè)反應(yīng)器中種泥的總EPS含量是一樣的，都是96.5 mg/g VSS。而馴化了30天后，兩個(gè)反應(yīng)器中的EPS含量分別是102.3和101.5 mg/g VSS。并在60天表現(xiàn)出來了差異性，反應(yīng)器A和B的總量分別是115.3和95.8mg/g VSS。
圖1反應(yīng)器中去除率的統(tǒng)計(jì)分析
3.2 SAD過程中啟動(dòng)，運(yùn)行和功能基因的定量分析
在第20天，RC有著更高的去除銨鹽和亞硝酸鹽的效率，硝酸鹽產(chǎn)出也比RA和RB低。第20-68天，銨鹽和亞硝酸鹽的去除效率達(dá)到86%和88%，在第96-124天，所有反應(yīng)器達(dá)到了穩(wěn)定狀態(tài)，而且很明顯RA中亞硝酸鹽的產(chǎn)出要高于其他兩個(gè)反應(yīng)器。
通過qPCR獲得第10天和120天三個(gè)污泥樣本中amoA，nxrA，Anammox 16S rRNA和nirS的豐度。明顯可以看出Anammox 16S rRNA和nirS的拷貝數(shù)要比amoA及nxrA高，說明厭氧氨氧化和反硝化細(xì)菌在三個(gè)反應(yīng)器的運(yùn)行中占主導(dǎo)地位。在第10天的三個(gè)反應(yīng)器中Anammox 16S rRNA和nirS有著幾乎一樣的基因拷貝數(shù)，但是110天之后，微生物菌群明顯就不同了。RA中的厭氧氨氧化基因的拷貝數(shù)要比RB和RC高很多，而在RC中nirS基因的拷貝數(shù)要比RA和RB高很多。
表1 反應(yīng)器運(yùn)行過程中各性能數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)
圖2 第10天和120天反應(yīng)器中功能基因拷貝數(shù)
3.3 三組污泥樣本中微生物多樣性和微生物菌群
從菌群的α多樣性分析結(jié)果中可以看到RC中微生物多樣性（Shannon和Simpson指數(shù)）略高些，在RA和RC中豐富度（OTU數(shù)，ACE和Chao1指數(shù)）比較低。說明OM和PAC的加入可能影響到了少數(shù)菌群的生長。
對(duì)三個(gè)反應(yīng)器樣本進(jìn)行Metastats差異分析，在門和屬水平上，發(fā)現(xiàn)RB和RC表現(xiàn)出相似的菌群，并且和RA有著明顯的微生物菌群進(jìn)化關(guān)系。同時(shí)通過韋恩圖分析結(jié)果證明RB和RC有著更相似的微生物菌群。
表2 三個(gè)反應(yīng)器中污泥樣本的微生物豐富度和多樣性評(píng)估
3.4三個(gè)反應(yīng)器中微生物菌群結(jié)構(gòu)和PAC對(duì)膜污染的影響
為了驗(yàn)證三組污泥樣本的細(xì)菌菌群差異，在門和屬水平上分析菌群的結(jié)構(gòu)組成。分析發(fā)現(xiàn)三個(gè)反應(yīng)器的樣本在門水平上的優(yōu)勢(shì)物種是Planctomycetes，Proteobacteria，OD1和Bacterioidetes，百分占比之和超過了50%。而且發(fā)現(xiàn)Planctomycetes在RA中的相對(duì)豐度明顯比RB和RC要高，OD1也是這樣的現(xiàn)象。同時(shí)發(fā)現(xiàn)Proteobacteria在RB和RC中的相對(duì)豐度也是高于RA，而且Bacterioidetes的這種趨勢(shì)更明顯。從相對(duì)豐度高于0.5%且排名前9的屬的豐度圖中可以看出，Candidatus Brocadia和Kuenenia在RA中要明顯高于RB和RC。而反硝化屬中Bacillus、Paracoccus、Bacteroides和Thauera在RA中的相對(duì)豐度要比RB和RC明顯低很多。
圖3 反應(yīng)器中門和屬水平上微生物菌群結(jié)構(gòu)圖譜
基于KEGG的菌群功能預(yù)測(cè)分析表明，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性相關(guān)的功能基因隨著OM的加入是有所減少的，而PAC的加入增強(qiáng)了這種減少趨勢(shì)。而膜轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的功能基因，隨著OM和PAC的加入得到了提高。還發(fā)現(xiàn)除了硝酸鹽還原酶和固氮酶，幾乎所有的反硝化代謝酶都隨著OM和PAC的加入而有所增強(qiáng)。從基于COG數(shù)據(jù)庫的分析結(jié)果中可以看出，挑選的17個(gè)鑒定到的基因中有14個(gè)是負(fù)責(zé)反硝化作用，4個(gè)是和厭氧氨氧化相關(guān)，1個(gè)是反硝化和厭氧氨氧化兩者功用的基因。其中，除了和硝酸鹽還原酶相關(guān)的基因外，負(fù)責(zé)反硝化作用的功能基因在RB和RC中的豐度是顯著高于RA的。而且發(fā)現(xiàn)RB的膜在第65天和108天時(shí)被阻塞和清掃，同時(shí)RC組的膜在第85天被清掃。說明PAC的添加是可以控制SAD過程中膜污染的一個(gè)有效方法。
圖4反硝化作用和厭氧氨氧化代謝酶的相對(duì)豐度
4 總結(jié)
在防污浸沒式厭氧膜生物反應(yīng)器中，發(fā)現(xiàn)厭氧氨氧化耦合反硝化（SAD）過程中有機(jī)質(zhì)（OM）和粉末活性炭（PAC）驅(qū)動(dòng)菌群發(fā)生了明顯變化。qPCR和高通量測(cè)序結(jié)果表明OM在微生物菌群進(jìn)化中有著關(guān)鍵性作用，推動(dòng)反硝化菌群挑戰(zhàn)厭氧氨氧化的優(yōu)勢(shì)主導(dǎo)地位。在SAD過程中添加PAC減輕了膜污染，同時(shí)刺激了反硝化細(xì)菌的豐度發(fā)生變化，導(dǎo)致優(yōu)勢(shì)門從Planctomycetes變?yōu)镻roteobacteria。SAD過程中的功能預(yù)測(cè)結(jié)果說明在低COD/N值下，OM和PAC可以驅(qū)動(dòng)反硝化作用。
參考文獻(xiàn)
Ge C H, Sun N, Kang Q, et al. Bacterial community evolutions driven by organic matter and powder activated carbon in simultaneous anammox and denitrification (SAD) process[J]. Bioresour Technol, 2017, 251:13-21.
原文鏈接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960852417321508
