2018-06-15
最近，派森諾生物與浙江大學合作，在《Water Research》（影響因子：6.942）發表論文，研究了各種實驗環境下，飲用水分配系統（Drinking water distribution system，DWDS）中微生物主導的2,4,6-三氯苯甲醚（Trichloroanisole，TCA）的形成過程，建立了相關動力學模型，并系統評估了管道材料、流速、溫度和殘余氯對2,4,6-TCA形成的影響。
研究背景
飲用水的味道和氣味（T&O）問題普遍存在，關注度高。在飲用水供應中，檢測到由包括土臭素（GSM，土味）、2-甲基異冰片（2-MIB，霉味）和2,4,6-三氯茴香醚（2,4,6-TCA，霉味/發霉）等多種主要化合物引起的T&O。以往的研究主要集中在常見微生物如放線菌、藍藻和真菌等產生的GSM和2-MIB，而對飲用水中2,4,6- TCA形成的研究較少。由于2,4,6-TCA在水處理和分配系統中的普遍性和對公共健康的潛在危害性，其形成動力學、機制和環境效應備受關注。
研究方法
測序技術：Illumina MiSeq高通量測序平臺
測序模式：微生物組細菌16S rRNA基因V3-V4區測序、真菌ITS1區測序
實驗對象：浙江大學DWDS試點系統
實驗設計：DWDS系統由三種材料制成的封閉環組成，包括聚乙烯（PE）、不銹鋼和球墨鑄鐵，尺寸約為80米，直徑為150毫米。試驗前，將試驗DWDS中的回路用城市淡水沖洗40分鐘。將2,4,6-TCP溶液分別注入PE、不銹鋼和球墨鑄鐵的3根管中，最終濃度為0.2 mg/L。在每個環中加入NaClO，最終濃度為3mg /L，研究殘余氯對2,4,6-TCA生成的影響。將一個100 mL的水樣收集在容量瓶中用于2,4,6-TCA分析，1 mL樣品收集在琥珀瓶中用于2,4,6-TCP分析。實驗過程中，以預先確定的時間間隔收集樣品，并在試驗DWDS中加入NaClO的同時測量樣品中的殘余氯。實驗后，通過用無菌棉簽擦拭管壁內部區域并懸浮在30mL無菌水中，用于16S rRNA基因和ITS1區測序，從而在每個系統中收集重復的生物膜樣品。
研究結果
1、2,4,6-TCA的動力學形成
隨著反應時間從0增加到50 h，2,4,6-TCA的濃度逐漸從0 ng/L增加到31.3 ng/L的最大值。然而，通過在無菌容器中加入0.2 mg/L的前體2,4,6-TCP，在對照試驗中未檢測到2,4,6-TCA。這表明DWDS管壁上附著的微生物是2,4,6-TCA的主要生產者。反應50 h后，只有10%的2,4,6-TCP降解或轉化為2,4,6-TCA，表明2,4,6-TCP到2,4,6-TCA的轉化率相對較低。由于前體2,4,6-TCP的濃度很高，在實驗中可視為常數，因此建立了準一級動力學模型，描述了2,4,6-TCA在DWDS中的形成情況如下：
2、水分配影響因素
2.1管道材料
球墨鑄鐵管和不銹鋼管（[TCA]max分別為385.00和320.01 ng/L）比PE管（[TCA]max為96.97 ng/L）產生更多的2,4,6-TCA。
2.2溫度
在這三種管材中，2,4,6-TCA的形成都是在相對較高的溫度（30℃）下進行的，增長率為7.23-53.50%。擬合動力形成學曲線后，發現2,4,6-TCA形成的擬一級速率常數也隨著溫度的升高而增加，這與Arrhenius定律相一致；在較高的溫度下，形成曲線趨于穩定。
2.3流速
為了估算DWDS中的液壓變化對2,4,6-TCA形成的影響，將流速調節為0.1 m/s，0.6 m/s和1.4 m/s，分別代表停滯，經濟和高速度。在5 h的反應時間和20 ℃的溫度下，在DWDS中生成的2,4,6-TCA濃度隨著這三種管道的流速增加而增加。隨流速的增加，2,4,6-TCA組的擬一級速率常數也增加。實際全尺寸DWD在采用低流速時具有較長的保留時間，有利于管壁微生物的生長。
2.4殘余氯
為了測試殘余氯對DWDS中2,4,6-TCA形成的影響，將3 mg/L的NaClO加入到試驗DWDS中，并且發現所產生的2,4,6-TCA濃度降低了24.27-39.68％。一方面，氯可以通過直接與茴香醚反應生成氯茴香醚，或者在水中與天然有機質（NOM）反應生成2,4,6-TCA。然而，在自來水氯化形成測試中沒有檢測到2,4,6-TCA，表明氯在調查的條件下產生2,4,6-TCA的作用很小。另一方面，氯可以通過抑制生物膜的微生物活性或氧化/氯化前體2,4,6-TCP來抑制2,4,6-TCA的形成。
3、2,4,6-TCA形成的微生物機制
管壁上的生物膜是DWDS中2,4,6-TCA的主要來源，管材是決定2,4,6-TCA形成水平的關鍵因素。
3.1 細菌數量
用HPC方法估計測定細菌的數量，PE、不銹鋼和球墨鑄鐵的管壁上分別為(3.74±0.65)*104、(2.22±0.41)*105和(3.50±0.51)*105CFU/cm2。三種管材的細菌數量級與形成的2,4,6-TCA濃度的數量級一致，表明微生物生物量可作為評估DWDS中2,4,6-TCA形成潛力的替代參數。該研究結果也觀察到不銹鋼或球墨鑄鐵管的細菌數量比PE管高一個數量級。
3.2 微生物群落組成和多樣性
細菌微生物被鑒定劃分到40個門，112個綱，213個目，356個科和559個屬；真菌微生物劃分到13個門，39個綱，101個目，209個科和368個屬。在管材方面，PE具有較高的細菌群落多樣性和豐富度，球墨鑄鐵真菌多樣性比較高，而不銹鋼中細菌和真菌多樣性相對較低。Beta多樣性分析表明，球墨鑄鐵和不銹鋼的微生物群落與PE的微生物群落具有較高的相似性。metastats分析表明，三種管壁生物膜的門和屬之間存在著顯著差異。研究發現，22個門和233個屬在細菌群落中豐度存在顯著差異，分別占門和屬的55%和42%。真菌群落中差異微生物較少，2個門和31個屬豐度差異較大，分別占門和屬的15%和8%。
圖1 （a）細菌和（b）真菌群落在試驗DWDS的生物膜中的分類等級樹分析。 排名前20的優勢類群標有字母A-T
圖2 試驗DWDS生物膜中的微生物群落豐度中具有顯著差異分類單元：細菌微生物組的門（a）和屬（b）以及真菌微生物組的門（c）和屬（d）
3.3 產2,4,6-TCA的微生物組合
共鑒定出6個細菌屬和11個真菌屬具有產生2,4,6-TCA的潛力，分別在細菌和真菌中具有2.33-3.17%和14.92-32.92%的相對豐度。大多數2,4,6-TCA產生屬在三種管壁上具有相對高的豐度和顯著不同的分布。在試驗DWDS的生物膜中產生2,4,6-TCA的微生物組合具有很強的生存能力，能夠在各種環境條件下生存。網絡分析表明，2,4,6-TCA產生屬和其他優勢屬之間可能存在多重協同作用。其中一些協作關聯可能有利于2,4,6-TCA的生產。PE、不銹鋼和球墨鑄鐵管壁上6種潛在2,4,6-TCA產生菌的總量分別為1176.56、7040.10和8173.40 CFU/cm2，這與三種管材的2,4,6-TCA形成量一致。
圖3 試驗DWDS生物膜中潛在2,4,6-TCA產生屬的豐度熱圖
圖4 在生物膜試點DWDS網絡分析潛在2,4,6-TCA生產屬與其他優勢屬（最豐富的前50）
3.4 CPOMTs酶的微生物活性
CPOMTs催化了2,4,6-TCA的微生物生成，CPOMTs的微生物活性直接決定了2,4,6-TCA的形成潛力。從KEGG（KO）數據庫中，根據它們的Phenol-O-methylation能力篩選出21種潛在的CPOMTs。基于KO數據庫的PICRUSt分析發現了兩個潛在的CPOMTs。兩種潛在的CPOMTs在三種材料管材上的總活動順序為球墨鑄鐵>不銹鋼>PE。因此，本研究證實了DWDS中2,4,6-TCA的形成潛力與屬微生物活性和酶水平之間的聯系。
4、2,4,6-TCA防治的討論
通過對2,4,6-TCA微生物形成的機理研究，為制定防治策略提供了重要的信息。表面相對光滑的PE管生物膜的生物量比表面粗糙的球墨鑄鐵或不銹鋼管要低得多。在實際應用中，為DWDS設計的管道產品的生物膜生產潛力和2,4,6-TCA形成潛力有必要被檢測，并將結果作為評價和選擇的重要標準。此外，一些具有抗菌性能的新型管材的研發是解決T&O問題的有效途徑。
總結
本研究表明，管材、溫度、流速、殘余氯等多種水分配因素都能影響2,4,6-TCA的形成。球墨鑄鐵和不銹鋼管道比PE管產生更多的2,4,6-TCA。經過Illumina MiSeq高通量測序的群落分析，發現球墨鑄鐵和不銹鋼的微生物群落具有較高的相似性。DWDS中2,4,6-TCA形成的主要機制是生物膜中微生物對前體2,4,6-TCP的O-甲基化。
文章索引：
Kejia Zhang , Cong Cao , Xinyan Zhou , Feifei Zheng , Youmin Sun , Zhengqing Cai ,
Jie Fu (2018).Pilot investigation on formation of 2,4,6-trichloroanisole via microbial
O-methylation of 2,4,6-trichlorophenol in drinking water distribution system: An insight into microbial mechanism .Water Research 131(2018) 11–21.
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https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0043135417310084
