2016-06-13
本期我們以鴨疫里默氏桿菌（Riemerellaanatipestifer）Yb2為材料，學習如何借助Miseq平臺進行全基因組序列分析，鑒定毒力基因！該研究成果由中國科學院上海獸醫研究所的于圣青團隊在線發表在國際學術期刊《Applied and Environmental Microbiology》(IF:3.668)，其中測序和分析工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
研究背景
鴨疫里默氏桿菌是一種能夠引起雞、鴨、鵝等鳥類患流行性傳染性漿膜炎的細菌，能夠給養鴨業帶來嚴重的經濟損失。不同的血清型和菌株之間毒力變化很大，目前除了毒力因子VAPD，CAMP溶血素和外模蛋白的相關報道，其他關于鴨疫里默氏桿菌致病的分子基礎知識報道很少。本研究通過Miseq平臺完成了對鴨疫里默氏桿菌Yb2的全基因組序列分析，借助隨機轉座子誘變和體內篩選鑒定出49個毒力基因，該數據對未來鴨疫里默氏桿菌基礎發病機制的研究提供遺傳基礎。
材料和方法
材料選取：
1、野生型鴨疫里默氏桿菌Yb2
2、雛鴨（來自上海莊行鴨場）進行轉座子隨機突變和減毒突變體的分離
測序平臺：Illumina MiSeq平臺
文庫：PE400和MP8K
分析內容
1、Yb2基因的預測和注釋
2、Yb2基因組的進化分析：SNP分析；共線性分析；同源性分析和系統發育樹重構
3、突變基因的鑒定和生物信息學分析
研究結果
1、鴨疫里默氏桿菌Yb2基因組特征
菌株Yb2有一個單一環狀的染色體，無證據證明質粒的存在，預測有一個CRISPR序列，有七個假基因，2021個開放閱讀框（ORF），平均長度976bp。KEGG注釋結果顯示，1217個ORFs被分到30不同的代謝途徑。
2、進化分析
對菌株DSM15868、RA-GD、RA-CH-1、RA-CH-2 和 Yb2 進行單核苷酸多態位點（SNP）、共線性和同源性分析發現RA-GD和Yb2的遺傳距離近。
3、隨機轉座子誘變和減毒突變株的分離
通過Tn4351插入突變失活構建突變體庫，利用動物體內篩選獲得超過100倍衰減毒力的突變體，通過轉座子插入失活鑒定出49個毒力基因。
4、突變基因編碼蛋白的生物信息學分析
通過PSORTb預測得到49個毒力基因編碼蛋白的亞細胞位置。其中，25個基因編碼產物為細胞質蛋白，6個基因編碼產物為細胞質膜蛋白，4個基因編碼產物為外膜蛋白，剩下的14個基因編碼產物的亞細胞定位尚不清楚。
結果展示圖
圖1. Yb2基因組注釋和GC偏移
圖2 鴨疫里默氏桿菌基因組序列示意圖總結通過轉座子隨機突變、體內篩選完成了鴨疫里默氏桿菌YB2的全基因組序列分析，鑒定出49個毒力基因，該研究為后續細菌鴨疫里默氏桿菌感染的耐藥性和持久性提供指導。
參考文獻：
Wang X, Ding C, Wang S, et al. Whole-Genome Sequence Analysis and Genome-Wide Virulence Gene Identification of Riemerellaanatipestifer Strain Yb2. Applied and Environmental Microbiology, 2015, 81(15): 5093-5102.
