2017-06-23
最近，派森諾生物與中國地質大學合作，在《Frontiers in Microbiology》（影響因子：4.165）發表論文，揭示了喀斯特地貌的生態系統中，微生物群落組成的變化與土壤pH值以及土壤酸化之間的內在聯系。
研究背景
喀斯特地貌，是具有溶蝕力的水對可溶性巖石（大多為石灰巖）進行溶蝕作用等所形成的地表和地下形態的總稱，廣泛分布于我國的云南、四川、重慶、貴州、湖南、湖北、廣東、廣西等多個省份。因此，我國是東亞重要的喀斯特地貌聚集區。然而，近年來，由人類頻繁活動誘發的酸雨及亞熱帶季風氣候引起的持續增強的降雨量，對我國的喀斯特地貌產生了顯著影響，引發了包括土壤酸化在內的一系列改變，對生態和農業都造成了不良后果。
研究目的
目前對喀斯特地貌特征下的土壤樣本已有不少研究，然而對喀斯特生態系統下的不同生境進行整合研究的案例相對匱乏。本研究旨在對具有典型喀斯特地貌特征的和尚洞生態系統中洞外洞內、自上而下的不同生境進行研究，旨在探究不同生境中的微生物群落組成與生境pH值等影響因素間的互作關系。
研究方法
測序技術：Illumina MiSeq高通量測序平臺
測序模式：微生物組細菌16S rRNA基因V4區測序
實驗對象：湖北省長陽縣具有喀斯特地貌特征的和尚洞內外的土壤樣本和水樣本
實驗設計：和尚洞外，分別采集4份被森林覆蓋的山頂土壤（MT）、3份農田土壤（FL）、3份洞頂土壤（CT）；在洞內，在靠近洞口的明亮處、洞中部的昏暗處、和洞內不透光的黑暗處分別采集表面沉積物樣本（SP、SD、SA）各3份、風化的碳酸巖樣本（WP、WD、WA）各3份；在洞中部昏暗處收集1份水滴樣本（DW3），在洞內黑暗處收集2份水滴樣本（DW1、DW2）。
研究結果
A，碳酸鹽基巖及酸雨在中國的地域分布；B，酸雨對可溶性碳酸鹽基巖的溶蝕作用模型；C和D，中國湖北省和尚洞地貌縱切面圖解以及洞內外取樣點示意圖。
對和尚洞中采集的樣品進行分析發現，除了4個山頂土壤（MT）之外的其他樣本均為微堿性，pH值介于7.28-8.35之間。水滴樣本（DW）中的TOC含量低，而來源于山頂（MT）和洞上方（CT）的洞外土壤樣本及洞內明亮處的風化碳酸鹽巖石樣本（WP）中的TOC含量較高。在樣本DW、MT、FL中未檢測到NH4+，而在CT中有NH4+存在。大多數樣本中NO3-的含量比NO2-高，CT除外。在所有固體樣本中，硫酸鹽的含量均比較相似，介于0.11-0.57 mM之間。水滴樣本中的NO3-和SO42-含量比大多數固體樣本更高。
對31份樣品的微生物組成進行高通量測序發現，Proteobacteria在風化巖石樣本WA1、WA2、WA3、WD3及山頂土壤樣本MT1、MT2、MT3中的占比為20-40%，在水滴樣本中的占比甚至超過60%。而Verrucomicrobia和Acidobacteria在固體樣本中的含量比在水滴樣本中要高。
結合聚類分析的豐度前10個門的組成分布熱圖
進一步分析顯示，Actinobacteria、Proteobacteria和Acidobacteria在堿性土壤中更占優勢。Actinobacteria在所有的風化碳酸鹽巖石樣品及表面沉積物樣品SD1和SD3中豐度較高（40%-60%）。在Proteobacteria門中，Alphaproteobacteria在酸性土壤和高TOC含量的碳酸鹽巖石樣本中的豐度高，而在低TOC含量的水滴樣本和堿性沉積物中含量較低。在低TOC含量的樣本中，Gammaproteobacteria和Betaproteobacteria的含量較高。
和尚洞不同生境中Proteobacteria門中不同物種的相對豐度分布
同時，Alpha多樣性分析顯示，洞中表面沉積物樣本的菌群多樣性程度高，而水滴樣本低。
和尚洞不同生境中的微生物群落多樣性
基于OTU的進一步分析表明，屬于OTU_13的Pseudonocardiales（Actinobacteria）和屬于OTU_22的Solirubrobacterales（Actinobacteria），在風化的碳酸鹽巖石中相對豐度較高。而屬于Chthoniobacterales（Verrucomicrobia）的OTU_47在洞外土壤樣本CT和MT中相對豐度較高。在水滴樣本中豐度高的為屬于Moraxellaceae（Gammaproteobacteria）的OTU_54。
和尚洞不同生境樣本中相對豐度≥2%的OTU聚類分析熱圖
基于Unifrac距離的加權PCoA主坐標分析顯示，洞外表面覆蓋土壤樣本MT、FL、CT和洞內明亮及黑暗處的表面沉積物樣本SP、SA具有相似的菌群組成結構；風化的碳酸鹽巖石樣本和洞內昏暗處表面沉積物樣本SD較為相似；而水滴樣本的菌群組成結構較為特殊，與其它樣本差異明顯。
和尚洞不同生境樣本基于Unifrac距離的加權PCoA主坐標分析
而LEfSe分析進一步顯示，不同的喀斯特地貌生境樣本的關鍵物種組成從門到屬均具有顯著差異。Actinobacteria在碳酸鹽巖石樣本（WA、WD、WP）中占有顯著優勢。Acidobacteria（18.85%）、Verrucomicrobia（12.9%）、Planctomycetes（9.9%）、Alphaproteobacteria（55%）和Deltaproteobacteria（20%）在洞外的表層覆蓋土壤樣本（MT、FL、CT）中普遍存在。而在洞內表面沉積物樣本（SA、SD、SP）中占比較大的為Chloroflexi（9.97%）、Nitrospirae（7.19%）、Gemmatimonadetes（4.61%） 以及Firmicutes（3.53%）。Proteobacteria（尤其是Gammaproteobacteria和Betaproteobacteria）在水滴樣本（SW）中占有優勢。而在屬水平上，Crossiella、Euzebya和Rubrobacter在碳酸鹽巖石樣本（WA、WD、WP）中占有優勢；Bradyrhizobium和Acidothermus在洞外的表層覆蓋土壤樣本中占據優勢；Gaiella在洞內表面沉積物樣本占據優勢；Sediminibacterium、Brevundimonas、Acidovorax、Hydrogenophaga、Polaromonas、Acinetobacter、Perlucidibac和Pseudomonas在水滴樣本中占據優勢。
LEfSe分析顯示不同生境下的顯著差異物種分布特征。屬水平字母簡稱依次代表：A，Crossiella；B，Euzebya；C，Rubrobacter；D，Bradyrhizobium；E，Acidothermus；F，Gaiella；G，Sediminibacterium；H，Brevundimonas；I，Acidovorax；J，Hydrogenophaga；K，Polaromonas；L，Acinetobacter；M，Perlucidibaca；N，Pseudomonas
本研究的另一個亮點在于，采集了不同生境樣本的12種環境參數，并通過RDA分析衡量這些影響因素與和尚洞生態系統中微生物組成結構之間的相互關系。結果顯示，在門水平，pH值（物種組成多樣性貢獻率為14.9%，P = 0.03）、TOC（9.8%，P = 0.022）和K+濃度（7.1%，P = 0.03）是與物種組成結構聯系緊密的三種環境因子。在綱水平，對Proteobacteria門下物種進行RDA分析所能解釋的信息量占比為53%，其中pH值和TOC占28.6%。不同門水平的物種組成結構與pH、TOC、K+的相關性不盡相同。在不同生境的樣本中，隨著pH值的增加，Acidobacteria、Verrucomicrobia和Planctomycetes的相對豐度顯著減少；而在酸性樣本中，Gemmatimonadetes和Firmicutes的相對豐度較高。pH值越高，Gammaproteobacteria和Betaproteobacteria的相對豐度越高。Acidobacteria、Verrucomicrobia和Planctomycetes的相對豐度和樣本中的TOC含量呈正相關。農田土壤樣本（FL）、大多數洞內沉積物樣本及水滴樣本的菌群組成結構與pH值呈正相關，與TOC和K+濃度呈負相關。在洞內風化巖石樣本中，只有Actinobacteria與K+濃度呈正相關。通過對洞外表層土壤樣本OTU水平的Shannon多樣性指數與pH值之間進行線性回歸分析發現，兩者之間具有較強的相關性。
不同環境參數對不同生境下菌群組成結構影響的RDA分析。A和B，所有生境樣本門水平的RDA分析；C，所有生境樣本Proteobacteria門下綱水平的RDA分析；D，洞外表層土壤樣本（MT、FL、CT）門水平的RDA分析。
洞外表層土壤樣本OTU水平的Shannon多樣性指數與pH值之間的線性回歸分析
總結
本研究表明，由酸雨和持續增強的季風性降雨導致的土壤酸化，使得包括洞外表層土壤、洞內沉積物、洞內風化的碳酸鹽巖石及落下的水滴在內的整個喀斯特生態系統的細菌菌群組成發生了顯著變化。這一變化主要與各生境中pH值、TOC和K+濃度改變有關，這些環境因素對喀斯特地貌不同生境的細菌菌群多樣性和物種組成具有顯著影響。
本研究的測序和數據分析工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
文章索引：
Yun Y, Wang H, Man B, Xiang X, Zhou J, Qiu X, Duan Y and Engel AS (2016) The Relationship between pH and Bacterial Communities in a Single Karst Ecosystem and Its Implication for Soil Acidification. Front. Microbiol. 7:1955. doi: 10.3389/fmicb.2016.01955
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