單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序揭示成年斑馬魚(yú)不同器官中巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞的異質(zhì)性
2023-11-23
單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)是指獲取單個(gè)細(xì)胞遺傳信息的測(cè)序技術(shù)，即在單個(gè)細(xì)胞水平上，對(duì)基因組或轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行提取擴(kuò)增和高通量測(cè)序分析，是探究細(xì)胞異質(zhì)性的利器。斑馬魚(yú)作為研究器官發(fā)育或免疫調(diào)控的重要模式動(dòng)物，是目前單細(xì)胞研究最多的水產(chǎn)生物，其單細(xì)胞研究也為其它水產(chǎn)生物奠定了基礎(chǔ)。今天我們就對(duì)近期發(fā)表的《Cell Reports》文章進(jìn)行解析，看單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)如何解析成年斑馬魚(yú)不同器官中巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞的異質(zhì)性。
組織駐留巨噬細(xì)胞(TRM)和樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)是天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在免疫、組織發(fā)育、組織動(dòng)態(tài)平衡和組織修復(fù)等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。此外，巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞在組成上也呈現(xiàn)出高度異質(zhì)性。近年來(lái)，隨著單細(xì)胞組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，各種組織和器官中均被鑒定出了不同類型的巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞亞群。然而，目前對(duì)于這些不同組織和器官中的亞群細(xì)胞在發(fā)育和功能上的關(guān)系仍然知之甚少。由于其保守的造血系統(tǒng)以及各種遺傳工具和命運(yùn)圖譜策略的可利用性，斑馬魚(yú)成為研究造血細(xì)胞（包括TRM和DC）發(fā)育的最佳模型系統(tǒng)。盡管斑馬魚(yú)巨噬細(xì)胞已經(jīng)被廣泛地研究了各種報(bào)告系和缺陷系，然而，斑馬魚(yú)的TRM異質(zhì)性和DC細(xì)胞的生物學(xué)特性在很大程度上仍不清楚。本研究利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序破譯成年斑馬魚(yú)中TRM和DC細(xì)胞的異質(zhì)性，為進(jìn)一步研究這些細(xì)胞的發(fā)育和功能特性提供了有價(jià)值的工具。
一、成年斑馬魚(yú)mpeg1.1+免疫細(xì)胞圖譜
為了系統(tǒng)性評(píng)估成年斑馬魚(yú)TRM和DC的異質(zhì)性，本研究利用標(biāo)記泛髓系細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)品系Tg (mpeg1.1:DsRedx)，通過(guò)流式細(xì)胞分選富集了6個(gè)不同器官（3個(gè)屏障組織（表皮、鰓、腸）和3個(gè)內(nèi)臟器官（肝、心臟和腦））中的mpeg1.1+細(xì)胞進(jìn)行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（圖1A）。分別對(duì)源于表皮：2,832鰓：3,711，腸：3,286；肝：3,248；心臟：3,679腦：2,842個(gè)高質(zhì)量單細(xì)胞進(jìn)行聚類分析，共注釋出8個(gè)細(xì)胞亞型（圖1B、1C）。本研究發(fā)現(xiàn)在所有的器官中均注釋出巨噬細(xì)胞和DC（圖1D）。
圖1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和成年斑馬魚(yú)mpeg1.1+免疫細(xì)胞圖譜展示
二、mpeg1.1+免疫細(xì)胞群在各個(gè)器官中高度保守
接下來(lái)，本研究通過(guò)結(jié)合來(lái)自所有器官的mpeg1.1+細(xì)胞群進(jìn)行比較分析，評(píng)估來(lái)自不同器官中相同細(xì)胞群體的轉(zhuǎn)錄模式的相似性。Pearson相關(guān)分析顯示，來(lái)自不同器官的相同細(xì)胞群通常高度相關(guān)（圖2A），結(jié)果表明每個(gè)細(xì)胞群體都有一個(gè)核心轉(zhuǎn)錄組特征，該特征定義了其身份并賦予了跨器官的特殊功能。為了確定不同細(xì)胞群體的核心轉(zhuǎn)錄組特征，本研究針對(duì)所有器官的細(xì)胞亞型進(jìn)行了亞型間差異表達(dá)基因（DEG）分析，發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞上調(diào)與吞噬作用相關(guān)的基因，如fcer1gl，scarb2a, lgals3bpa等。此外，所有器官中的巨噬細(xì)胞和DC細(xì)胞顯示出保守的譜系特異性轉(zhuǎn)錄因子(Tf)的表達(dá)，如巨噬細(xì)胞中的cebpa和mafbb，以及DC中的id2a和znf366（圖2C）。它們是經(jīng)過(guò)前期研究對(duì)巨噬細(xì)胞和DC細(xì)胞跨物種發(fā)育至關(guān)重要的調(diào)控因子。綜上所述，本研究定義了斑馬魚(yú)器官中不同mpeg1.1+免疫細(xì)胞群的核心轉(zhuǎn)錄組特征，并揭示了可能參與其發(fā)育的譜系特異性轉(zhuǎn)錄因子。
圖2 mpeg1.1+免疫細(xì)胞群跨器官特征分析
三、在屏障組織、肝臟和心臟中存在兩個(gè)功能不同的巨噬細(xì)胞亞群
為了進(jìn)一步表征巨噬細(xì)胞的異質(zhì)性，本研究提取了所有器官的巨噬細(xì)胞，并以更高的分辨率重新進(jìn)行降維聚類，注釋出lgals3bpb+巨噬細(xì)胞和ccl34a4+巨噬細(xì)胞，它們?cè)谄琳辖M織、肝臟和心臟中具有不同的分布模式，與lgals3bpb+巨噬細(xì)胞不同，ccl34a4+巨噬細(xì)胞分別是肝臟中的主要巨噬細(xì)胞群和心臟中唯一的巨噬細(xì)胞群（圖3A、3B、3C）。亞型間差異表達(dá)基因（DEG）分析發(fā)現(xiàn)Lgals3bpb+巨噬細(xì)胞高水平表達(dá)與吞噬作用相關(guān)的基因，如lgas 13bpa等，表明其強(qiáng)大的吞噬功能。此外，Lgals3bpb+巨噬細(xì)胞高表達(dá)炎性趨化因子，如cxcl8a等，表明其具有促炎能力。這些數(shù)據(jù)表明，lgals3bpb+巨噬細(xì)胞具有較強(qiáng)的吞噬和免疫細(xì)胞募集能力，具有促炎作用。因此，本研究將lgals3bpb+巨噬細(xì)胞群定義為促炎巨噬細(xì)胞（pro-inflammatory macrophages）。另一方面，ccl34a4+巨噬細(xì)胞最顯著的特征是它們廣泛表達(dá)與組織重塑和再生有關(guān)的基因，如timp2b等。ccl34a4+巨噬細(xì)胞可能在正常器官發(fā)育和組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)維持中發(fā)揮關(guān)鍵作用，故本研究將ccl34a4+巨噬細(xì)胞命名為促重塑巨噬細(xì)胞（pro-remodeling macrophages）（圖3D、3E、3F）。為了探索這兩個(gè)巨噬細(xì)胞亞群之間的譜系關(guān)系，本研究分析了兩個(gè)MP亞群在不同器官中轉(zhuǎn)錄因子的差異表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)群體差異表達(dá)了許多與巨噬細(xì)胞發(fā)育和功能特化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子（圖3G）。綜上，這兩個(gè)功能不同的巨噬細(xì)胞亞群可能經(jīng)歷了不同的發(fā)育途徑，受到不同的遺傳程序的調(diào)節(jié)。
圖3 跨器官的兩個(gè)不同功能的MP亞群的鑒定
四、斑馬魚(yú)體內(nèi)cDCs和pDCs的存在
為了進(jìn)一步表征樹(shù)突細(xì)胞的異質(zhì)性，本研究提取了所有器官的樹(shù)突細(xì)胞，并以更高的分辨率重新進(jìn)行降維聚類，注釋出cDCs細(xì)胞和pDCs細(xì)胞，在屏障組織、肝臟和心臟中，檢測(cè)到一個(gè)主要的cDC亞群，斑馬魚(yú)cDCs高表達(dá)ccl35(包括ccl35.1和ccl35.2)和核受體4a2b(Nr4a2b)基因，這些發(fā)現(xiàn)表明，斑馬魚(yú)cDCs可能作為抗原呈遞細(xì)胞發(fā)揮作用，并可能發(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)作用。另一方面，斑馬魚(yú)pDCs明顯表達(dá)高水平的組織蛋白BB(Ctsbb)和嘌呤能受體p2x3a(P2rx3a)基因，表明它們?cè)诳共《緫?yīng)答中的專門(mén)作用（圖4A、4B、4C和4D）,綜上所述，這些結(jié)果表明斑馬魚(yú)在成體器官中擁有功能保守的cDCs和pDCs，它們構(gòu)成了有效的免疫系統(tǒng)來(lái)應(yīng)對(duì)各種病原體的入侵。
圖4 屏障組織、肝臟和心臟中cDCs和pDCs的鑒定
五、吞噬性小膠質(zhì)細(xì)胞和調(diào)節(jié)性DCs存在于成年斑馬魚(yú)大腦中
本研究在成年斑馬魚(yú)大腦中鑒定了巨噬細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和不同DC細(xì)胞群，包括cDCs和pDCs（圖5A）。作為大腦駐留的巨噬細(xì)胞，小膠質(zhì)細(xì)胞在調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）的發(fā)育和功能方面起著至關(guān)重要的作用，基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)其特異性表達(dá)小鼠和人類小膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記基因，如p2ry12、apoeb、apoc1、sall3a和sall3b（圖5B），表明斑馬魚(yú)小膠質(zhì)細(xì)胞具有進(jìn)化保守的轉(zhuǎn)錄譜。與只有一個(gè)cDCs群的屏障組織、肝臟和心臟不同，大腦具有兩個(gè)不同的轉(zhuǎn)錄cDC亞群，cnn3a+cDCs和ccl35+cDCs（圖5C和5D），跨器官分析發(fā)現(xiàn)腦內(nèi)ccl35+cDC亞群更像在其他五個(gè)器官中鑒定的常見(jiàn)ccl35+cDCs（圖5E）。與MHCII類相關(guān)基因表達(dá)較高的ccl35+cDCs相比，腦特異性cnn3a+cDCs表達(dá)哺乳動(dòng)物cDC1標(biāo)記基因，如xcr1a.1、hepaca2和batf3（圖5F），這表明其與ccl35+cDCs存在潛在的功能和譜系差異。綜上，本研究在斑馬魚(yú)腦中發(fā)現(xiàn)著一類組織特異的cDC細(xì)胞亞群，其高表達(dá)了與免疫調(diào)節(jié)和神經(jīng)保護(hù)相關(guān)的基因，預(yù)示了這些細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和免疫穩(wěn)態(tài)維持中具有重要作用。
圖5 斑馬魚(yú)大腦中吞噬性小膠質(zhì)細(xì)胞和調(diào)節(jié)性DCs的特性
本研究系統(tǒng)性地解析了成年斑馬魚(yú)不同器官中巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞的異質(zhì)性，且基于這些不同巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞亞群的標(biāo)志基因，建立了多個(gè)特異性轉(zhuǎn)基因報(bào)告魚(yú)品系，為深入研究這些細(xì)胞亞群的發(fā)育和功能提供了有價(jià)值的工具和資源。
