2017-06-28
BSA（Bulk segregant analysis）稱為混合分組分析法，是近年來興起的一種快速簡單的性狀定位的方法。廣泛運用于擬南芥、水稻、玉米、黃瓜等物種上。BSA的特點之一就是將兩種極端性狀的子代個體混合測序（pool-seq）。但BSA絕對不是混池測序這么簡單，實際上根據群體材料、實驗設計的不同，BSA又有各種不同的方法。接下來就為大家一一介紹。
QTL-seq
QTL即數量性狀位點，在定位QTL時需要挑選兩個性狀差異較大（抗病/感病、高桿/矮桿）的純合親本進行雜交，構建F2群體或RIL群體。由于研究的數量性狀，子代表型不會非此即彼，而是在群體中呈連續的正態分布。選擇表現出極端性狀的20~30個個體進行混池測序，比如極端感病和極端抗病、最高和最矮的個體。我們通常選擇要研究的性狀的親本作為參考序列，將混池測序的reads比對到參考序列，計算SNP-Index。因為基因遺傳的隨機性，大部分SNP-index會在0.5附近。但與所研究性狀相關QTL區域，兩個混池間SNP-index差異會非常大，通過這一原理我們可以將性狀相關QTL大致定位到基因組上某一區域。
MutMap
當面對通過EMS誘變產生的突變性狀時，我們采取了與QTL不同的方法，稱之為MutMap即Mutation+Map。該方法先將突變體與野生型親本進行雜交，得到F1代。F1代再自交得到F2代，在F2代中選擇突變型個體進行混池測序。然后將測序得到的reads比對到親本基因組上，計算SNP-index。由于突變體為純合個體，性狀相關SNP-index應該為1，由于連鎖關系，相鄰位點SNP-index也會增加。其余無關SNP位點的SNP-index為0.5。因此SNP-index圖會出現一個峰值，性狀相關候選基因就位于該區域內。Mutmap的方法雜交時間短，相對于QTL定位更加省時高效；由于突變個體純合，背景更純，噪音少；只用對突變體混池和野生型親本進行測序，成本更低，分析更簡單。
Mutmap+
Mutmap在針對EMS誘導突變的性狀研究中優勢非常明顯，但并不是所有性狀都適合用Mutmap的方法。對于純合突變致死、不育或者嚴格自交且人工雜交困難的物種就無法使用Mutmap的方法進行研究。莫慌！有新的方法可以應對，我們稱之為Mutmap+。該方法是將EMS誘導產生的突變體M1自交產生M2，選擇M2中含有突變基因的野生型個體進行自交產生M3。M3發生性狀分離，選擇M3子代中野生型和突變型各20株個體，混池測序。將reads分別比對到親本的基因組上，計算SNP-index。由于M2許多突變位點已經純合，M3上很多區域SNP-index為1。但與突變位點相關的SNP-index為1是只有突變池才有的。所以計算△SNP-index，去除背景噪音，就可以找到突變所在基因區域，定位突變基因。
Mutmap-gap
對于以重測序為基礎的分析內容，都需要有參考基因組。但往往研究的樣本與數據庫中的參考基因組屬于不同品系，因此基因組上存在一定的差異。如果EMS誘導的突變發生在一個參考基因組沒有的基因上，那么用上述的MutMap和MutMap+就無法找出該候選基因。而MutMap-Gap的方法就是結合了MutMap和de novo組裝的一種基因定位方法，從而解決參考基因缺失位點上的基因突變問題。
Mutmap-Gap首先將所研究品系的野生型和參考基因組比對，得到所研究品系的參考基因組。然后利用EMS誘變，再進行MutMap分析，得到SNP-index圖。對位于SNP-index圖peak區域內的基因進行分析，如果在這個區域內找不到跟突變性狀相關的基因，那么突變位點很有可能就在品系特有基因區域內。這時候我們將之前比對不上參考基因組的野生型親本unmapped reads，和位于這個peak區域的野生型親本mapped reads一起進行de novo組裝，得到潛在的新基因，再以此為參考計算SNP-index。
總結：
這四種方法都是基于純合基因型親本的，都是通過將雜交家系中具有極端性狀個體混合測序，計算SNP-index，來實現基因定位。不同點在于需要測序的樣本以及其適用范圍。QTL-seq需要測序的為兩個親本和兩個極端性狀子代混池，適用于質量性狀、有明顯主效基因的數量性狀；Mutmap需要測序的樣本為突變型子代混池和野生型親本，適用于誘變突變性狀；Mutpmap+需要測序的樣本包括野生型親本、突變型子代池和野生型子代池，適用于早期致死突變或無法異交的突變株；Mutmap-Gap適用于目標基因不在物種參考基因組上的性狀。
但總的來講，相對于其他的性狀定位方法，利用BSA技術進行性狀定位周期更短，價格更低，定位效果更好。
參考文獻
[1] Takagi H, Abe A, Yoshida K, Kosugi S et al. 2013. QTL-seq: rapid mapping of quantitative trait loci in rice by whole genome resequencing of DNA from two bulked populations. The Plant Journal (2013) 74, 174–183
[2] Abe A, Kosugi S, Yoshida K, Natsume S, Takagi H, Kanzaki H, Matsumura H, Yoshida K, Mitsuoka C, Tamiru M et al. 2012. Genome sequencing reveals agronomically important loci in rice using MutMap. Nature Biotechnology 30: 174–178.
[3] Fekih R, Takagi H, Tamiru M, Abe A, Natsume S, et al. 2013 MutMap+: Genetic Mapping and Mutant Identification without Crossing in Rice. PLOS ONE 8(7): e68529.
[4] Takagi H1, Uemura A, Yaegashi H, Tamiru M, Abe A, Mitsuoka C, Utsushi H, Natsume et al. 2013. MutMap-Gap: whole-genome resequencing of mutant F2 progeny bulk combined with de novo assembly of gap regions identifies the rice blast resistance gene Pii.New phytologist New Phytologist 2013 200(1):276–283.
