2021-07-15
單細胞轉錄組學（sc-RNAseq）研究，可以更加有效的解釋組織的異質性，從單個細胞分辨率來解釋更多bulk水平上難以解釋的生物學問題。已經廣泛用于腫瘤異質性、細胞發育、免疫微環境等課題研究。其產生的海量數據以及個性化分析越來越受到重視，并需要新的方法來挖掘背后的生物學意義。
生物標志物以及候選基因的挖掘在腫瘤免疫和細胞發育等研究中一直是研究的重點和熱門。已有的生物標志物是基于差異分析或者無尺度網絡中核心基因的方法來進行挖掘的；但是這些方法只能挖掘靜態的生物標志物；而忽略了大多數疾病以及生物學過程，如腫瘤進展和免疫反應等都是一個動態變化的過程[1]。不同于靜態的分析方法，動態生物標志物（DNB）方法是一種基于穩健的隱馬爾可夫數學模型，對具有時序的組學數據進行網絡水平的建模，主要用于生物學系統的臨界時期或者臨界狀態進行鑒定，很適合生物學過程的研究（圖1）。例如，2018年發表在《Nat Commun》的一項研究對肝癌原位移植小鼠的進行建模開展 DNB 的研究，基于轉錄組學基因表達圖譜，檢測肝癌肺轉移的早期預警信號；進一步通過 DNB 評分獲得了DNB核心基因鈣離子傳導蛋白基因（Calmodulin-like-protein 3，CALML3），通過實驗驗證表明與 CALML3 與肝癌增殖、侵襲、侵移呈正相關，而且證實了敲低 CALML3 能夠作為轉移的抑制劑[2]。
圖1：DNB優勢doi:10.1038/nrd.2016.233
同時DNB 是一種基于“數據驅動”的方法，沒有先驗假設，無需事先指定功能相關基因集，單細胞轉錄組測序產生的基于單個細胞水平的數據很適合用于DNB 分析；然而目前DNB主要用于具有時序性的轉錄組數據（TCGA）或者表達芯片數據（GEO）的研究[3]（圖2），將DNB方法用于單細胞轉錄組可以進一步揭示特定細胞的分化臨界時期或者生物學變化臨界點，具有重要的意義和價值。
圖2 使用DNB對TCGA數據庫中癌癥臨界點的預警（doi:10.3389/fbioe.2020.00809）
下面給大家介紹一篇將動態網絡生物標志物用于單細胞轉錄組學的文獻，該文獻[4]于2021年6月發表在《Molecular Therapy – Oncolytics》（2020 IF = 7.2）上（圖3）。
圖3論文doi：10.1016/j.omto.2021.06.004
基于癌旁組織（adjacent tissue）作為一個過渡狀態，癌旁組織作為癌組織的窗口前置階段，有作為預測腫瘤早期進展的潛力。B細胞作為體液免疫的主要執行者。成熟B細胞可以分化為漿細胞，同時參與抗腫瘤免疫反應。文章主要思路是運用動態網絡生物標志物(DNB)，從系統生物學角度量化結直腸癌鄰近組織中成熟B細胞在調控網絡中的免疫功能，從而預測CRC轉移前的關鍵時期，挖掘具有潛在早期干預的靶點，為進一步研究B細胞在CRC進展中的作用提供候選基因（圖4）。
圖4 DNB應用于B細胞免疫過程
圖5 細胞重聚類
通過B細胞多區域的動態圖景，研究注釋了一類表達模式具有顯著差異的成熟B細胞（圖5）；運用DNB量化了成熟B細胞在癌旁組織的免疫活性的變化，檢測到了二期，作為結直腸癌淋巴結轉移前的臨界時期。通過對DNB調控網絡的分析發現，DNB對鄰居差異基因（DEG）具有“滯后”的調控作用，具體表現在CRC進展過程中，差異基因在二期表達處于過渡狀態，在一期和三期之間發生了表達模式翻轉變化；DNB基因在二期高表達（圖6）。通過進一步研究DNB的調控關系，發現了影響B細胞發育的JAK-STAT和抗原呈遞等免疫功能受到DNB基因STAT3、DHX9的調控（圖7A）；JAK-STAT通路參與成熟B細胞發育等過程STAT3（DNB）會使下游DEG表達發生翻轉促進 B cell凋亡，進而促進CRC進展（圖7B）。值得注意的是STAT3在臨界點前后表達差異并不顯著，其作為一個“暗箱”基因參與著重要的作用。對DNB基因進行了進一步篩選，DNB核心基因DHX9是結直腸癌癌旁組織特異性的預后標志物和潛在的免疫靶點（圖7C和7D）。
圖6 DNB-DEG滯后調控網絡
圖7 DNB核心基因的篩選
總之，該篇文章整合了系統生物學、單細胞轉錄組學、免疫學等多學科內容，表明CRC二期作為早期淋巴結轉移前的關鍵時期；同時DHX9作為預后標志物和潛在的免疫靶點，為CRC的早期干預提供了重要的線索，為進一步研究B細胞在CRC進展中的作用提供了候選基因。
動態網絡標志物的方法在具有時序性單細胞數據具有適用性和應用價值；很多生物學過程，例如T細胞耗竭、巨噬細胞M1-M2極化等過程都很適用于單細胞DNB分析；但是值得注意的具有時序的單細胞數據在實驗周期和成本上獲取具有難度，已有的單細胞擬時序分析或許可以定義出具有時間序列的數據，是一個很好的替代方案；最后動態網絡生物標志物的方法有望整合空間轉錄組學的信息，為挖掘具有時空特異性的分子標志物提供了可行性。
Ref:
[1] Lesterhuis, W., Bosco, A., Millward, M. et al. Dynamic versus static biomarkers in cancer immune checkpoint blockade: unravelling complexity. Nat Rev Drug Discov 16, 264–272 (2017). https://doi.org/10.1038/nrd.2016.233
[2] Yang B, Li M, Tang W, Liu W, Zhang S, Chen L, Xia J. Dynamic network biomarker indicates pulmonary metastasis at the tipping point of hepatocellular carcinoma. Nat Commun. 2018 Feb 14;9(1):678. doi: 10.1038/s41467-018-03024-2. PMID: 29445139; PMCID: PMC5813207.
[3] Han C, Zhong J, Hu J, Liu H, Liu R and Ling F (2020) Single-Sample Node Entropy for Molecular Transition in Pre-deterioration Stage of Cancer. Front. Bioeng. Biotechnol. 8:809. doi: 10.3389/fbioe.2020.00809
[4] Huisheng L, Jiayuan Z, Jiaqi H, Chongyin H, Rui L, Xueqing Y, Shiping L, Pei C, Rui L, Fei L, Single-cell transcriptome analysis reveals DHX9 in mature B cell as a dynamic network biomarker before lymph node metastasis in colorectal adjacent tissues, Molecular Therapy: Oncolytics (2021), doi: https://doi.org/
