2021-06-10
生物體正常的生理功能依賴于復雜的細胞及分子通過復雜的網絡相互作用推進和完成，生物體的復雜程度在細胞類型、細胞比例、細胞的空間位置、細胞的基因表達、細胞間的通訊互作、染色質的狀態、基因的序列等眾多維度實現精準調控。單細胞測序作為新出現的強有力工具，正是解析細胞網絡的合適技術手段，它通過一次性對數以萬計的細胞進行檢測，繪制出組織或器官的細胞圖譜，明確細胞間的調控模式和狀態變化，為解析生命機制提供細胞層次分辨率的系統見解。隨著對科學研究的不斷深入，單細胞測序（ScRNA-seq）的帝國包含了單細胞轉錄組測序，空間轉錄組測序、單細胞ATAC測序和單細胞免疫組等幾個重量級產品，在不同水平揭示了組織內部的異質性。近期，有越來越多的研究者關注了單細胞核測序（SnRNA-seq）。相較于ScRNA-seq的針對單個細胞進行測序，SnRNA-seq制備單細胞核懸液，針對單個細胞核進行測序和分析。今天，小編為大家詳細比較以下兩者的優劣勢，看看兩者更適用于怎樣的研究場景。
ScRNA-seq的局限
1、 僅適用于新鮮組織樣本
影響ScRNA-seq結果的關鍵因素是單細胞懸液的質量，ScRNA-seq對細胞懸液的質量要求非常高（細胞數量、活性、濃度、背景干擾等），因此細胞懸液的制備只適用于新鮮組織或者凍存后復蘇組織（主要是前者），這限制了ScRNA-seq的應用范圍，意味著保存在超低溫冰箱中、具有重要科研和臨床價值的大量珍貴樣本無法進行scRNA測序。
2、解離導致某些細胞類型的丟失
眾所周知，解離過程中不同類型細胞在解離效率上存在差異，與免疫細胞相比，成纖維細胞和內皮細胞更多嵌于細胞外基質和基底膜中，因此更難以分解【2】；同時一些較為敏感的細胞可能會因為解離過度而破碎，因此解離過程大概率無法有效的獲取到組織中的所有細胞類型，導致結果的準確性大為降低。
3、不適用于含大細胞的樣本類型
部分樣本類型，例如心臟、肌肉、脂肪組織含有直徑較大的心肌細胞、骨骼肌細胞和成熟的脂肪細胞，這些細胞的共同點均是“大”，例如心臟中大的心肌細胞，長和寬分別能達到100μm/25μm，而目前商業化的單細胞平臺對細胞大小均有限制，以10X Genomics平臺為例，其芯片中微管道直徑為50μm，建議捕獲的細胞不要超過40μm，因此上機捕獲前需要經過30-40μm細胞篩過濾去除大細胞。如果研究的樣本類型為心臟、脂肪等且關注心肌細胞、脂肪細胞信息，ScRNA-seq就不再是一個合適的選擇。
基于以上列出的ScRNA-seq的局限性，SnRNA-seq開始在一些研究中被廣泛應用，以腦組織單細胞轉錄組研究為例，目前大多數文章更傾向于實用SnRNA-seq，包括神經細胞【3-5】、心臟【6、7】、腎臟【8、9】、肝臟【10、11】、脂肪【12、13】等。
SnRNA-seq的優勢
已經有大量文獻證明，SnRNA-seq能夠解決ScRNA-seq中存在的主要問題，其優勢主要體現如下：
1、適用樣本類型豐富，操作步驟相對簡單
由于核膜穩定性比細胞膜高，因此組織凍存后細胞核膜不會被破壞，因此凍存組織可以提核做SnRNA-seq，提高了單細胞測序的樣本類型和實驗設計豐富度。
2、降低人為引入的轉錄偏差
因為組織可以直接從凍存狀態開始抽核，此狀態下細胞轉錄活動已經被抑制并固定，因此不會再發生轉錄狀態改變，結果真實性提高。
3、相對提高細胞類型的全面性
直接凍存狀態下對細胞進行機械破碎或者化學破碎，不會再出現酶解法引入的解離偏好性，相對而言細胞回收的全面性更高。通過比較分析了腎臟組織利用dropseq和10x兩種平臺的ScRNA-seq和SnRNA-seq的區別，發現SnRNA-seq的結果中包含了很多在scRNA中不存在的細胞類型，腎小球足細胞的比例增加了20倍【14】。
SnRNA-seq的劣勢
雖然SnRNA-seq相比較ScRNA-seq具有多方面的優勢，但同樣SnRNA-seq的劣勢也比較明顯：
1、檢測到的基因少
SnRNA-seq只能檢測細胞核中的mRNA, 缺失對細胞質中的mRNA分子的檢測。同時由于細胞核中帶有polyA尾的成熟mRNA比例更低，因此對于某些樣本而言，采用SnRNA-seq每個細胞核中檢測到的基因會偏少，不利于細胞亞型的鑒定。
2、獲得免疫細胞較少
雖然上文提到SnRNA-seq可以提高細胞檢測的全面性，但是其在某些細胞類型的再現上并沒有優勢。2020年發表在Nature Medicine的一篇文章【15】，對不同腫瘤類型的新鮮/冷凍樣本進行ScRNA-seq和SnRNA-seq， 結果顯示兩種方法檢測到的細胞類型相似，但比例差別較大：在神經母細胞瘤中， 相比SnRNA-seq，ScRNA-Seq中免疫細胞比例更高，神經嵴、神經內分泌細胞等實質細胞大幅減少；而SnRNA-Seq結果中實質性細胞（尤其是惡性細胞）比例更高，但是T細胞大幅減少，B細胞和NK細胞基本消失，內皮細胞、上皮細胞增加。
總結
總體而言，若針對凍存樣本、細胞直徑大于40um以及相對較難解離的植物樣本，建議采用SnRNA-seq；一些較難解離的動物樣本，派森諾的單細胞研發團隊可提供一對一個性化的解離方案，讓科學研究多一種選擇。派森諾對肌肉、胰腺、骨骼等各類組織都擁有效果更佳的單細胞懸液制備經驗。某些具體情況，則要根據研究目的進行個性化地調整。例如，關注肝癌樣本中的肝實質細胞，SnRNA-seq是更佳的方案；關注肝癌樣本中的免疫細胞，ScRNA-seq是更加方案。若關注肝癌樣本中的肝實質細胞和免疫細胞，則可聯系您身邊的派森諾銷售，讓派森諾的資深技術支持，提供個性化的實驗方案。
參考文獻：
1、Defining cell types and states with single-cell genomics
2、Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations
3、A single-nuclei RNA sequencing study of Mendelian and sporadic AD in the human brain
4、Alzheimer's Patient Microglia Exhibit Enhanced Aging and Unique Transcriptional Activation
5、A Spatiomolecular Map of the Striatum
6、Cells of the adult human heart
7、Transcriptional heterogeneity of fibroblasts is a hallmark of the aging heart
8、A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys
9、Complementary Roles for Single-Nucleus and Single-Cell RNA Sequencing in Kidney Disease Research
10、Single-Nuclei RNA Sequencing Assessment of the Hepatic Effects of 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin
11、Characterizing the Heterogeneity of Liver Cell Populations Under a NASH-Related Hepatotoxicant Using Single-Nuclei RNA Sequencing
12、Plasticity of Epididymal Adipose Tissue in Response to Diet-Induced Obesity at Single-Nucleus Resolution
13、SnRNA-seq reveals a subpopulation of adipocytes that regulates thermogenesis
14、Advantages of Single-Nucleus over Single-Cell RNA Sequencing of Adult Kidney: Rare Cell Types and Novel Cell States Revealed in Fibrosis
15、A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors
