2021-06-03
今天給大家分享一篇于2021年2月發(fā)表于《NATURE COMMUNICATIONS》的一篇應(yīng)用單細(xì)胞免疫組技術(shù)的文章，文章題目為《Tumour heterogeneity and intercellular networks of nasopharyngeal carcinoma at single cell resolution》。
文章題目簡單直接的概括了當(dāng)今腫瘤研究的熱點(diǎn)，TME(腫瘤微環(huán)境)與intercellular networks（細(xì)胞之間互作）。
接下來小編借著這篇文章與大家分享一下，當(dāng)今熱門的腫瘤微環(huán)境等熱點(diǎn)研究是如何與單細(xì)胞免疫組相結(jié)合的。
樣本隊(duì)列
作者一共入組了10例NPC（鼻咽癌）病例，取了腫瘤與血液配對樣本，基于10X平臺(tái)完成了5’ mRNA表達(dá)譜測序與TCR測序。 注：小編經(jīng)驗(yàn)，研究過程中如果不確定所關(guān)注的樣本里面是否有足夠比例的免疫細(xì)胞做VDJ seq, 建議可以流式等技術(shù)做下確認(rèn)，并且也方便與后續(xù)的單細(xì)胞樣本細(xì)胞比例進(jìn)行互相驗(yàn)證。
分析內(nèi)容
細(xì)胞捕獲結(jié)果：數(shù)據(jù)量方面，平均每個(gè)樣本測了380，000，000條reads，大約在120GB左右，數(shù)據(jù)的飽和度大約在90.75% (75.90%–94.50%)。經(jīng)過作者嚴(yán)格的質(zhì)控（多細(xì)胞，基因數(shù)較少的細(xì)胞）之后，一共獲得了176447個(gè)細(xì)胞，其中（82,622 來自腫瘤，93,825來自PBMC）。
常規(guī)分析
通過對細(xì)胞進(jìn)行降維，獲得細(xì)胞亞群。作者選用了主流的R 包 Seurat進(jìn)行了處理。同時(shí)，基于每個(gè)亞群高表達(dá)的基因與常規(guī)的marker作者進(jìn)行了細(xì)胞亞群的注釋，CD4T細(xì)胞（基因標(biāo)記：PTPRC、CD3D、CD4）、CD8T細(xì)胞（PTPRC、CD3D、CD8A）、骨髓細(xì)胞（CD14、用于CD11C的ITGAX）、B細(xì)胞（CD19，MS4A1）和NK細(xì)胞（FCGR3A和NCAM1）、除此之外，作者還在TME細(xì)胞中鑒定到56個(gè)成纖維細(xì)胞與7個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞，基于這些分析結(jié)果，作者對用不同的展示方式對數(shù)據(jù)進(jìn)行了多種描述。
UMAP降維圖
（關(guān)于umap和tsne的差別可以單開一期細(xì)講，概括來說，TSNE所分出的群和群之間的距離遠(yuǎn)近是沒有意義的，但是UMAP是有的。為了方便客戶，我們的標(biāo)準(zhǔn)報(bào)告中兩種降維方式都提供了。）
喜聞樂見的marker細(xì)胞映射圖
不同來源的UMAP映射圖
細(xì)胞數(shù)目占比圖
再分群來揭示免疫細(xì)胞的異質(zhì)性與免疫組庫的多樣性
接下來作者將141,875個(gè)NK細(xì)胞、T細(xì)胞放在一起進(jìn)行了聚類，一共分成了32個(gè)亞群。完成每個(gè)亞群的定義之后，作者通過亞群之間的差異分析觀察到一系列差異表達(dá)的基因，挑選出其中的一些明星基因進(jìn)行了介紹，例如耗竭相關(guān)的exhaustion markers (LAG3, TIGIT,PDCD1, HAVCR2, and CTLA4)，效應(yīng)殺傷性相關(guān)的markers effector molecules (GZMB,GZMK, INFG, NKG7, GNLY, and IL2)在某些特定的細(xì)胞類群里面高表達(dá)，由此可以解釋T細(xì)胞在TME環(huán)境中的抗腫瘤的同時(shí)也受抑制等現(xiàn)象。接下來，作者就對其中幾個(gè)亞群進(jìn)行了一下描述（比如哪一類亞群表達(dá)怎樣的特征，表達(dá)怎樣的基因，在樣本間有無數(shù)量上的差異. Etc.）。
細(xì)致的T、NK細(xì)胞亞群分類
單細(xì)胞免疫組測序不僅包括5'轉(zhuǎn)錄組測序，還包含了對于TCR/BCR的測序組裝，相對于常規(guī)的3'單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組可以獲得更多的信息。所以接下來，作者引入了TCR測序結(jié)果，首先作者發(fā)現(xiàn)不同樣本間沒有共享的TCR克隆型。同時(shí)，作者發(fā)現(xiàn)這些NPC樣本都具有一定的VJ偏好性。
VJ配對圈圖
（本公司的報(bào)告中也包含嗷）
對于高變的CDR3(免疫組測序可以獲得全長序列)的研究發(fā)現(xiàn)，CAVRGTGTASKLTF and CASSFSGANVLTF 這兩條序列已經(jīng)被確認(rèn)與MLANA和EBV抗原有關(guān)。同時(shí)，與單細(xì)胞的亞群分類結(jié)果相結(jié)合分析，作者發(fā)現(xiàn)，CD4和CD8T細(xì)胞都有更多的克隆型，而且不同的細(xì)胞具有相同的TCR克隆型，這表明在腫瘤抗原連續(xù)刺激后，腫瘤浸潤T細(xì)胞的克隆擴(kuò)張。
CD8+細(xì)胞的多樣性與耗竭T細(xì)胞的分化產(chǎn)生
接下來，作者主要關(guān)注了CD8+T 細(xì)胞亞群，常規(guī)介紹了這些亞群的表達(dá)特征，在不同組別中的分布特點(diǎn)，然后與上文一樣，通過差異分析和富集分析開始說明具體的細(xì)胞亞群功能，例如，舉例腫瘤細(xì)胞毒性CD8T細(xì)胞簇(CD8_C7_GZMK、CD8_C8_MHC和CD8_C9_XCL1)具有與細(xì)胞因子產(chǎn)生和淋巴細(xì)胞激活相關(guān)的途徑富集；CD8_C5_CX3CR1富集在白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移和白細(xì)胞遷移相關(guān)的途徑中。接下來，作者通過擬時(shí)序分析來說明CD8+T不同狀態(tài)下的過度與表達(dá)情況。值得一提的是作者使用了TCR、基因表達(dá)對T細(xì)胞的擴(kuò)增分布、遷移和轉(zhuǎn)化能力等進(jìn)行了量化。并且與擬時(shí)序分析進(jìn)行了結(jié)合，作者發(fā)現(xiàn)腫瘤內(nèi)耗竭的CD8+T細(xì)胞和發(fā)揮免疫抑制的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可能分別來源于外周血中的CX3CR1+CD8+T細(xì)胞和幼稚的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。CX3CR1+CD8+T細(xì)胞不僅具有高細(xì)胞毒性和高遷移能力，并且與腫瘤內(nèi)浸潤的CD8+T細(xì)胞共享大約10%的TCR克隆型。這些結(jié)果說明，CX3CR1+CD8+T細(xì)胞具有潛在滲透進(jìn)入腫瘤組織的能力，并且可以通過TCR識(shí)別殺傷腫瘤細(xì)胞。這些結(jié)果亦提示潛在的細(xì)胞治療策略，即可以通過在體外擴(kuò)增鼻咽癌病人外周血中的CX3CR1+CD8+T細(xì)胞亞群，再回輸?shù)讲∪梭w內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞治療；或者利用CX3CR1修飾T細(xì)胞來增強(qiáng)T細(xì)胞的遷移和進(jìn)入腫瘤的能力。
NPC中Treg細(xì)胞的多樣性和發(fā)展軌跡
接下來作者運(yùn)用了與CD8+T 分析類似的方法，首先將11,631個(gè)細(xì)胞分在了4個(gè)細(xì)胞簇中，分別為Treg_C1_SELL、Treg_C2_HSPA1A、Treg_C3_MKI67和Treg_C4_TNFRSF4，接下來依舊是比較這些細(xì)胞在組間的差異。接下來，作者進(jìn)一步提出了對每一個(gè)細(xì)胞計(jì)算IL2R scores ，即基于CD25 (IL2RA), CD122(IL2RB), and CD132 (IL2RG)等基因（這三個(gè)基因編碼跨膜蛋白，形成一個(gè)受體復(fù)合體，競爭性結(jié)合TL2(T細(xì)胞生長因子)，以抑制效應(yīng)T細(xì)胞）的表達(dá)水平來進(jìn)行計(jì)算【派森諾新版高級(jí)分析也包括該項(xiàng)目】。然后基于這些細(xì)胞的評(píng)分比較不同Treg cluster間的差異。
接下來作者繼續(xù)使用了Monocle2來推斷腫瘤內(nèi)Treg的起源，分析發(fā)現(xiàn) Treg_C4_TNFRSF4作為終末端來源于兩種發(fā)育軌跡，其一是來源于PBMC的Treg_C1_SELL，其二是來源于腫瘤的Treg_C3_MKI67，同時(shí)根據(jù)假時(shí)間軌跡分析，大多數(shù)Treg_C2_HSPA1A細(xì)胞都在腫瘤中，起源于Treg_C1_SELL細(xì)胞(常駐標(biāo)記物的缺失表達(dá)可能表明最近從PBMC中招募了Treg_C2_HSPA1A細(xì)胞。
Treg擬時(shí)序分析圖
作者又結(jié)合了TCR對CD4+T 進(jìn)行了進(jìn)一步的討論，在47384個(gè)CD4+T細(xì)胞中，共有17624檢測到了明確的克隆型。其中Treg_C2_HSPA1A和Treg_C4_TNFRSF4克隆下數(shù)量中等。值得注意的是，在所有的CD4+T細(xì)胞中，Treg_C4_TNFRSF4的克隆細(xì)胞比例最大，這意味著克隆更為豐富。同時(shí)，Treg_C4_TNFRSF4也是在Treg細(xì)胞簇中克隆擴(kuò)增最多的。同時(shí)通過差異基因表達(dá)分析可知，Treg_C1_SELL的趨化因子受體CCR4表達(dá)很高，這與NPC中CCL5、CCLC17和CCL22所對應(yīng)。這些觀察結(jié)果表明，與瘤內(nèi)細(xì)胞的遷移能力和趨化相互作用使外周Treg_C1_SELL細(xì)胞有可能向腫瘤募集。接下來作者使用TCR補(bǔ)充了這個(gè)驗(yàn)證，觀察到來自腫瘤和外周血的Treg細(xì)胞之間有少量共享的TCR。總的來說，作者使用了擬時(shí)序分析、差異分析、配受體關(guān)系與TCR等方法共同驗(yàn)證了這一結(jié)論。
NPC中B細(xì)胞的多樣性（B細(xì)胞亞群分析）
解析完T細(xì)胞，作者接下來對B細(xì)胞進(jìn)行了討論。作者將22892個(gè)B細(xì)胞分成了9個(gè)亞群，其中3個(gè)亞群來自PBMC，另外6個(gè)來自腫瘤組織。
通過差異分析可以發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞特異表達(dá)的一些基因，例如干擾素誘導(dǎo)基因、應(yīng)激基因等。接下來，作者發(fā)現(xiàn)B_C4_IFITM3、B_C5_ISG15和B_C6_HSPA1A等細(xì)胞亞群在“EBV感染”、“病毒的防御反應(yīng)”、“病毒致癌”和“干擾素-伽馬的響應(yīng)” 等途徑富集，暗示這三個(gè)亞群可能參與EBV感染的免疫反應(yīng)。
腫瘤相關(guān)的LAMP3+DCs在NPC中顯示出耐受性表型（髓樣細(xì)胞亞群分析）
通過對8893個(gè)髓樣細(xì)胞進(jìn)行聚類分析，共獲得10和亞群，其中5個(gè)單核/巨噬細(xì)胞，三個(gè)經(jīng)典DCs，一個(gè)漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞（pDCs）。
在四個(gè)樹突狀細(xì)胞簇中，DC_C2_CD1C、DC_C3_LAMP3和DC_C4_JCHAIN來源于腫瘤，而DC_C1_FCER1A來源于PBMC。
作者將其中高表達(dá)與成熟相關(guān)的特征基因（LAMP3、MARCKSL1、IDO1、UBD）、激活相關(guān)的特征基因（CD80、CD40）和遷移（CCR7、FSCN1、SLCO5A1）的DC_C3_LAMP3拿出來進(jìn)行了單獨(dú)的討論。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)， DC_C3_LAMP3高表達(dá)多個(gè)趨化因子配體（CCL17、CCL19和CCL22），由此推斷可以招募表達(dá)相關(guān)受體的免疫細(xì)胞，根據(jù)這些特征，作者定義DC_C3_LAMP3為之前報(bào)道過在腫瘤中廣泛存在的LAMP3+ DCs。
通過GO和KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，DC_C3_LAMP3在細(xì)胞凋亡、NF-κB和MAPK信號(hào)途徑以及骨髓樣細(xì)胞分化等途徑均有所上調(diào)。
通過擬時(shí)序分析發(fā)現(xiàn)DC_C1_FCER1A可以發(fā)展形成DC_C2_CD1C和DC_C3_LAMP3，其中DC_C3_LAMP3處在終末，說明其處最成熟的分化完全狀態(tài)。聯(lián)合轉(zhuǎn)錄因子分析，作者構(gòu)建了鼻咽癌病人外周血與腫瘤微環(huán)境之間樹突狀細(xì)胞的遷移、分化和轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)了KDM2B、KLF6、NFKB1、TRAFD1、HMGN3和JUN等轉(zhuǎn)錄因子對促進(jìn)LAMP3+樹突狀細(xì)胞的成熟，降低抗原呈遞能力和增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)能力相當(dāng)重要。通過靶向這些轉(zhuǎn)錄因子可能會(huì)使LAMP3+樹突狀細(xì)胞重塑為正常的抗原呈遞表型，從而使LAMP3+樹突狀細(xì)胞在鼻咽癌患者體內(nèi)重新發(fā)揮激活免疫的功能。
不同EBV感染狀態(tài)的惡性細(xì)胞的異質(zhì)性(惡性上皮細(xì)胞的亞群分析)
作者使用infercnv通過對比正常上皮細(xì)胞來檢測腫瘤細(xì)胞中發(fā)生拷貝數(shù)變異的上皮細(xì)胞（惡性上皮細(xì)胞）。
由于EBV是導(dǎo)致NPC惡性轉(zhuǎn)換與腫瘤發(fā)生的一個(gè)已知因素，作者根據(jù)EBV分子（(LMP-1/BNLF2a/b, RPMS1/A73, LMP-2A/B, BNRF1）的表達(dá)與否將這些惡性細(xì)胞分為EBV+(EP_C1_LMP1) and EBV? (EP_C2_EPCAM)。作者觀察到，與EP_C2_EPCAM細(xì)胞相比，EP_C1_LMP1中涉及NF-κB和Notch通路的主要基因和CX3CL1在內(nèi)的趨化因子都高表達(dá)，并且外周血多種免疫細(xì)胞都高表達(dá)了CX3CL1的受體CX3CR1。進(jìn)一步作者使用信號(hào)通路富集分析表明，EP_C1_LMP1富集在細(xì)胞因子介導(dǎo)、調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡、細(xì)胞凋亡和癌癥相關(guān)途徑。
接下來作者使用常規(guī)的分群將這些細(xì)胞分成了五個(gè)亞群，并且使用了GSVA來計(jì)算每個(gè)細(xì)胞的通路評(píng)分。然后通過差異分析找到每個(gè)亞群中的差異通路。這也是可以說明細(xì)胞間的異質(zhì)性的一種方法。
NPC中不同細(xì)胞間的通訊
既然上面作者在多個(gè)亞群分析里面都或多或少的提了配受體基因的高表達(dá)，所以在這一part，作者就詳細(xì)討論了細(xì)胞亞群之間的配受體通訊。作者使用了CellPhoneDB進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析。接下來就是詳細(xì)的描述這些通訊關(guān)系了，比如作者觀察到DC_C3_LAMP3細(xì)胞、Treg細(xì)胞和耗竭CD8T細(xì)胞(CD8_C11_PDCD1)通過抑制性、共刺激分子或趨化因子之間的密集細(xì)胞相互作用，再比如DC_C3_LAMP3細(xì)胞亞群可以通過CCL17-CCR4和CCL22-CCR4與PBMC中的Treg_C1_SELL細(xì)胞相互作用，CCR4通過將Treg細(xì)胞招募到腫瘤組織。Treg_C4_TNFRSF4細(xì)胞的CTLA4、ENTPD1和CSF1表達(dá)很高，這表明DC_C3_LAMP3細(xì)胞上的配體受體與CD80/CD86、ADORA2A和SIRPA結(jié)合，可以說明 Treg_C4_TNFRSF4和DC_C3_LAMP3細(xì)胞之間有潛在的相互作用。總而言之，根據(jù)細(xì)胞間通訊可以得到很多有用的信息的，對于了解不同細(xì)胞亞群間的互作網(wǎng)絡(luò)是十分有幫助的。
總 結(jié)
通過對NPC隊(duì)列進(jìn)行單細(xì)胞免疫組測序，基于細(xì)胞亞群的再分群，然后對逐個(gè)細(xì)胞亞群細(xì)致的描述與挖掘，結(jié)合不同的分析手段（擬時(shí)序、GSVA、差異分析、細(xì)胞通訊分析）與TCR信息共同驗(yàn)證結(jié)論，鑒定了對鼻咽癌腫瘤發(fā)生過程中重要的細(xì)胞亞群和分子、CDR3序列，把對于鼻咽癌腫瘤的研究推向了更加精細(xì)的單細(xì)胞層面。
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