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【干貨分享】單細(xì)胞測(cè)序和空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序解析人的腸發(fā)育

2021-01-25

單細(xì)胞測(cè)序聯(lián)合空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，拿到數(shù)據(jù)以后，到底如何進(jìn)一步分析，才能發(fā)表高分文章？相信這個(gè)問(wèn)題困擾著每一個(gè)研究者。

今天，小編解讀一篇最新發(fā)表于cell的利用單細(xì)胞測(cè)序和空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序解析人腸發(fā)育的文章。看看大牛是如何分析單細(xì)胞測(cè)序結(jié)果和空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，如何將兩者進(jìn)行聯(lián)合分析，運(yùn)用了什么樣的研究思路，采用了什么樣的分析方法，解釋發(fā)育過(guò)程中的重要的生物學(xué)問(wèn)題。

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作者針對(duì)17個(gè)胚胎的77個(gè)樣本進(jìn)行了單細(xì)胞測(cè)序，捕獲到76592個(gè)細(xì)胞。這些細(xì)胞可以分成內(nèi)皮，成纖維細(xì)胞，上皮，外周血，神經(jīng)元，肌肉，間充質(zhì)細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞和免疫細(xì)胞9大類(lèi)，并對(duì)各細(xì)胞類(lèi)型的marker基因進(jìn)行了分析。這些分析，屬于單細(xì)胞測(cè)序分析的標(biāo)配。

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不同細(xì)胞類(lèi)型的分化和形成，是微環(huán)境中細(xì)胞外部因子結(jié)合到細(xì)胞的受體上，完成了外界信號(hào)傳遞入細(xì)胞，隨后依賴(lài)于轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控，完成外界信號(hào)到基因表達(dá)的級(jí)聯(lián)調(diào)控，從而控制細(xì)胞的分化和發(fā)育。因此，作者對(duì)各個(gè)細(xì)胞類(lèi)型的轉(zhuǎn)錄因子和ligand-receptor關(guān)系進(jìn)行了細(xì)致的分析，鑒定了多個(gè)決定細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞間通訊關(guān)系。

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此外，作者針對(duì)5個(gè)樣本取了8張切片進(jìn)行空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。首先分析在不同空轉(zhuǎn)切片上，分別分布了哪些cluster。結(jié)合單細(xì)胞測(cè)序結(jié)果，分析關(guān)注的細(xì)胞類(lèi)型在空轉(zhuǎn)切片上的分布，并比較不同區(qū)域組織在細(xì)胞類(lèi)型分布上的異同。此外，比較不同切片的相對(duì)應(yīng)區(qū)域內(nèi)的差異表達(dá)基因及其這些基因富集的信號(hào)通路，揭示該區(qū)域內(nèi)發(fā)生的生物學(xué)過(guò)程以及該生物學(xué)過(guò)程在不同樣本間的差異。

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作者隨后針對(duì)重要的細(xì)胞大群進(jìn)行深入的分析，此處選取上皮細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步分析。細(xì)胞分群結(jié)果顯示上皮細(xì)胞可以分成15個(gè)亞群，這15個(gè)亞群在不同部位、不同發(fā)育時(shí)期是呈現(xiàn)特異性的分布，并通過(guò)不同亞群的marker基因?qū)喨旱念?lèi)別進(jìn)行判定。隨后針對(duì)不同亞群的細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行分析，此處分析不同發(fā)育時(shí)期不同亞群的數(shù)目，結(jié)果顯示，近端干細(xì)胞和遠(yuǎn)端干細(xì)胞隨著發(fā)育過(guò)程細(xì)胞數(shù)量逐漸增多。那么，在早期干細(xì)胞的數(shù)目很低的時(shí)候，是什么細(xì)胞在執(zhí)行干細(xì)胞的功能呢？作者關(guān)注到早期細(xì)胞數(shù)量比較多的是近端上皮干細(xì)胞祖細(xì)胞。擬時(shí)序分析結(jié)果顯示上皮干細(xì)胞祖細(xì)胞可發(fā)育為上皮細(xì)胞。上皮干細(xì)胞祖細(xì)胞中表達(dá)了多個(gè)細(xì)胞分化的基因，如GATA4,TF,LGR5等，并對(duì)這些基因的表達(dá)做了免疫組化驗(yàn)證；對(duì)上皮干細(xì)胞的起源，做了進(jìn)一步的追溯。

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分泌細(xì)胞在12周的胚胎中可被檢測(cè)到，并在之后完成細(xì)胞數(shù)目的大量擴(kuò)增，說(shuō)明其發(fā)育從12周開(kāi)始。此外，通過(guò)ligand-receptor的分析，發(fā)現(xiàn)內(nèi)分泌相關(guān)的細(xì)胞可分泌ligand結(jié)合到多種抑制性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞的受體，這個(gè)過(guò)程也是在12周的胚胎開(kāi)始進(jìn)行。以上結(jié)果說(shuō)明分泌細(xì)胞的多樣性在腸隱窩形成過(guò)程中建立。

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類(lèi)似的思路，作者對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行了分群，通過(guò)比較不同發(fā)育時(shí)期的不同類(lèi)別細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目，發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈細(xì)胞數(shù)目增多，說(shuō)明在此過(guò)程中進(jìn)行血管發(fā)育。針對(duì)marker基因的分析，ligand-receptor分析，鑒定ANGPT2是胚胎發(fā)育過(guò)程中血管形成的關(guān)鍵調(diào)控因子。

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成纖維細(xì)胞可以重新分群為S1,S2,S3,S4四個(gè)大群，其中S3在胚胎發(fā)育時(shí)期的含量特別多，所以作者尤其關(guān)注了S3亞群。在擬時(shí)序結(jié)果中顯示，未成熟S3位于細(xì)胞演化的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，一部分演化成S3，一部分演化成S1/2/4。進(jìn)一步地，對(duì)S3細(xì)胞的ligand-receptor分析顯示，S3細(xì)胞通過(guò)LRP1受體與不同類(lèi)別細(xì)胞進(jìn)行通訊。在空轉(zhuǎn)的結(jié)果上，可見(jiàn)LRP1與其ligand的共表達(dá)。

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完成了對(duì)不同類(lèi)別細(xì)胞的細(xì)致分析之后，揭示小腸這個(gè)組織的形態(tài)建成的調(diào)控機(jī)制，即分析不同細(xì)胞類(lèi)型之間的協(xié)同發(fā)育，應(yīng)該是更具有生物學(xué)意義的問(wèn)題。作者建立了一個(gè)形成基因模塊分析方法，具體為以已經(jīng)報(bào)道的與發(fā)育相關(guān)的信號(hào)通路為起點(diǎn)，針對(duì)單細(xì)胞測(cè)序的轉(zhuǎn)錄組和空轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行WGCNA分析，那么這些基因所在的基因module以及這些基因module里的基因，可能是參與這些發(fā)育過(guò)程的基因。

前人報(bào)道了S2型成纖維細(xì)胞通過(guò)表達(dá)TGF-β和WNT信號(hào)通路的ligand促進(jìn)上皮細(xì)胞的發(fā)育。因此，表達(dá)了TGF-β和WNT信號(hào)通路的S2成纖維細(xì)胞成為研究重點(diǎn)。這些細(xì)胞中表達(dá)了TGF-β通路的BMP2,BMP4和BMP5以及WNT信號(hào)通路的WNT5A,WNT5B。那么，這些基因又成為了研究重點(diǎn)。分析這些基因所在的單細(xì)胞測(cè)序的module（module2）的基因，即共表達(dá)基因，篩選到DLL1,BMP5和NRG1。又通過(guò)ligand-receptr分析，發(fā)現(xiàn)S2成纖維細(xì)胞與上皮細(xì)胞形成具有較強(qiáng)的細(xì)胞間通訊。用類(lèi)似的方法，作者對(duì)免疫細(xì)胞和S4成纖維細(xì)胞的發(fā)育以及病原微生物感染的發(fā)育過(guò)程進(jìn)行了詳細(xì)的闡釋?zhuān)@里不做進(jìn)一步討論。

總結(jié)而言，分析方法，還是常用的分析方法，如細(xì)胞分群，marker基因表達(dá)分析，擬時(shí)序分析，細(xì)胞間通訊分析，WGCNA分析等。關(guān)鍵的問(wèn)題是，到底關(guān)注哪些細(xì)胞，關(guān)注哪些基因。也就是說(shuō)，做這些常規(guī)分析時(shí)，到底挑選哪些數(shù)據(jù)作為輸入文件？這是一個(gè)研究過(guò)程中的關(guān)鍵問(wèn)題。科研道路路漫漫其修遠(yuǎn)兮，只有通過(guò)不斷地思考生物學(xué)問(wèn)題，提出生物學(xué)問(wèn)題，才能針對(duì)生物學(xué)問(wèn)題進(jìn)行針對(duì)性地分析，才能解決生物學(xué)問(wèn)題。

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