2020-12-30
經過上一篇-關于DIA技術，你想了解的都在這里了(點擊查看)，相信大家現在對DIA技術已經有了一定了解。這一次我們趁熱打鐵，來康康DIA技術的應用。
一起來回顧下DIA技術的優勢吧： 1、全景式掃描，數據無遺漏，蛋白質覆蓋率、定量準確性高； 2、樣本無需分餾分上機，極大縮短了每個樣品的檢測周期；不受樣本量限制，可用于大規模樣本數量檢測； 3、相比于DDA模式，DIA缺失值更少，鑒定與定量結果的可重復性更高，數據可回溯。 DIA技術到底行不行？下面我們來看一篇文章。 Optimization of Data-Independent Acquisition Mass Spectrometry for Deep and Highly Sensitive Proteomic Analysis 研究對象：人胚胎腎細胞；小鼠 期刊：Int J Mol Sci. 影響因子：4.556 發表時間：2019年11月 關鍵詞：DIA; 蛋白質組學; label-free定量 研究背景 生物樣品中蛋白質表達的動態范圍非常廣，而且生物學和醫學領域關注的的激酶和轉錄因子的表達水平又較低，所以蛋白質的鑒定和定量難度大大增加。因此本文通過優化DIA和LC的條件，建立了一套高靈敏度和覆蓋度的蛋白質組學分析流程。 研究結果 1.蛋白質鑒定數量 DIA-MS比常規DDA-MS鑒定到更多的蛋白質和肽段，其中oDIA-MS鑒定出的蛋白質的肽段最多，其次是nDIA-MS（圖1A,B）。 圖1 鑒定的肽段和蛋白質組數目 （normal window DIA- nDIA，variable window DIA- vDIA，overlapping window DIA- oDIA） 2.DIA定量重現性以及準確性 樣品為人胚胎腎細胞（HEK293F digest），實驗做了8個重復，并比較不同重復之間的蛋白表達豐度。皮爾森系數R≥0.99，變異系數中位數為4.41% （圖2 A,B），表明oDIA的定量重現性較好。 圖2 皮爾森相關分析（A）和CV柱狀圖（B） 樣品 A ：200 ng HEK293F digest 和 20 ng yeast digest，樣品B：200 ng HEK293F digest 和 10 ng yeast digest (圖3C)。如火山圖所示，human protein趨近于log20，yeast protein趨近于log21，表明了該技術較高的定量準確性。 圖3蛋白質表達豐度火山圖 3. 低豐度蛋白 共鑒定出7868個蛋白組。其中有18個上調蛋白，27個下調蛋白，在GF（germ-free mice）和 SPF（specific pathogen-free mice）比較組中共有45個顯著差異的蛋白質(圖4A,B)，其中包括Ino80c、Phf1、Ccnl2、Ern1和Hells等轉錄因子。此外有文獻報道，顯著差異蛋白中的S100a9， Bhlhb9、Hmgcs2、Id、 Nqo1、Carns1、Rbm3和Dab1與神經性疾病有關。 圖4 GF vs SPF 火山圖和熱圖 總結 相較于傳統的 DDA 定量，DIA 定量方法具有蛋白質覆蓋率和定量準確性高、不受樣本量限制，可用于大規模樣本數量檢測、鑒定與定量結果的可重復性更高、數據可回溯等優點。 鑒于 DIA 定量二級譜圖的復雜性，需要先采用 DDA 方式構建一個譜圖庫。建庫的成本稍高，對于大樣本量的老師較為適用。畢竟，還有 money，你懂的。
