2020-12-29
免疫細胞針對紛繁復雜的入侵的病原體（抗原）的免疫反應，依賴于其高度多樣性的抗原識別受體B細胞表面受體（B cell receptor ,BCR）和T細胞表面受體（TCR）。BCR由四條肽鏈構成，由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈連接而成（重鏈和輕鏈分別由不同基因編碼），其中重鏈分為可變區(Variable regions, V區)、恒定區(Constant regions，C區)、跨膜區及胞質區，而輕鏈則只有V區和C區。TCR是高度多樣化的異源二聚體，由大多數T細胞表達的α和β鏈（αβ TCR）的組成，或由外周血中的T細胞（1-5%）和在粘膜部位發現的T細胞表達的γδ鏈（γδ TCR）組成。TCR α和δ鏈的可變區由多個可變的（V）和連接（J）基因編碼，而TCR β和γ鏈由多樣性（D）基因編碼。
無論是BCR的輕鏈還是重鏈，都可以分為可變區（V區）和恒定區（C區），其中V區由2~3個基因片段拼接而成，具有極高的多樣性，決定了BCR與抗原的結合能力。輕鏈的V區由V基因片段和J基因片段構成；重鏈除上述兩者之外，還有一個D基因片段。V、J基因片段在個體胚系基因組上相互遠離。但在B細胞內，通過重排，原來相互遠離的V和J基因區段接合產生了連續的外顯子，其編碼整個輕鏈V區。進一步在轉錄后，通過RNA剪接將V區外顯子連接到C區外顯子上，構成完整的輕鏈mRNA，進一步可以表達為輕鏈蛋白。將D基因片段連接到J基因片段形成DJ片段，然后一個V基因片段重排至DJ片段，形成一個完整的V區外顯子。然后與輕鏈基因一樣，RNA剪接將組裝的V區序列連接到鄰近的C區序列形成完整的mRNA，進一步可以表達為重鏈蛋白。
TCRα類似BCR輕鏈編碼基因，含有V和J基因片段（V α和J α）。TCRβ類似BCR重鏈編碼基因，除Vβ和Jβ基因片段外，還含有Dβ片段。同樣的，也是經歷通過DNA重組和mRNA剪切兩個步驟，完成了不同類別的TCR序列的表達。
當病原微生物入侵時，招募不同類別的免疫細胞，不同免疫細胞表達不同的轉錄組；此外，不同的B細胞和T細胞產生不同的BCR和TCR識別抗原，部分B細胞和T細胞擴增，形成具有相同BCR和TCR序列的多個細胞，該過程成為克隆型擴增。因此，當病原微生物入侵時，體內的免疫狀態呈現了多維度的異質性，此時，想要更精細地了解異質性信息，僅關注轉錄組已經無法滿足需求，針對BCR和TCR的VDJ序列的異質性，10Xgenomics公司推出了在cDNA的基礎上，進一步進行擴增子測序，通過分析BCR和TCR的不同序列，分析免疫環境中的克隆型多樣性，解析有機體抵制病原微生物入侵的免疫機制。
10Xgenomics的單細胞BCR/TCR測序的原理，與單細胞轉錄組類似，通過微流控系統將帶有條形碼和引物的凝膠珠與單個細胞包裹在油滴中；接下來在每個油滴內，凝膠珠溶解，細胞裂解釋放 mRNA，通過逆轉錄產生帶有 10X barcode 和 UMI 信息的 cDNA。破油（Breaking Emulsions）之后，cDNA 一分為二，后續同時進行基因表達和免疫組庫的文庫構建。其中 TCR 或者 BCR 的 V(D)J 序列通過設計在 C 區的巢式引物進行 PCR 富集；而 mRNA 的信息，與 10X Genomics 3’mRNA 文庫不同，保留的是 5’端的信息。測序后即可一次性獲得大量單細胞的基因表達和免疫組庫數據。結合轉錄組測序數據與BCR/TCR多樣性數據，解析免疫細胞中更高維度的異質性。
樣本要求
1）細胞類型：T細胞、PBMC、 B細胞、腫瘤細胞；
2）細胞來源：血液提取、磁珠富集、流式分選、組織解離、體外擴增、冷凍保存；
3）細胞大小：直徑<40 μm；
4）細胞濃度：5×105~1.2×106/ml；
5）細胞活性：>90%；
6）細胞數目：≥ 1×105 cells/sample。
7）保存運輸：為了減少運輸過程及反復凍融對細胞造成的損傷，派森諾可提供上門服務！
