2017-08-16
最新一期Clinical Cancer Research (IF: 9.619)上刊登了美國明尼蘇達大學研究團隊關(guān)于前列腺癌腫瘤標志物的最新研究成果，文章題為“Androgen receptor variant AR-V9 is co-expressed with AR-V7 in prostate cancer metastases and predicts abiraterone resistance”。該研究團隊采用PacBio全長轉(zhuǎn)錄本測序（Iso-Seq）的方法對前列腺癌化療的抗性標志物——雄激素受體變異體（AR-V）的轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)特征進行深入分析。雄激素受體（Androgen receptor，AR）是正常前列腺細胞以及前列腺癌細胞中最主要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。已有研究表明，雄激素受體AR-V7是不依賴配體的轉(zhuǎn)錄因子，會促進前列腺癌對AR靶向治療產(chǎn)生抗性，臨床上已將AR-V7作為一種生物標志物，并建立了監(jiān)測和抑制AR-V7表達的方法。由于受二代測序讀長的限制，無法對完整的AR及AR轉(zhuǎn)錄本異構(gòu)體進行準確定量，因此研究人員無法搞清楚是否有其它的AR變異體與AR-V7共同表達，從而促進對AR靶向治療的抗性。為了解決這個瓶頸，明尼蘇達大學的研究團隊采用PacBio 單分子測序技術(shù)，無需片段化、無需組裝，直接對全長轉(zhuǎn)錄本進行測序，確定了完整的AR及AR轉(zhuǎn)錄本異構(gòu)體的外顯子結(jié)構(gòu)，并估算了它們的豐度。作者發(fā)現(xiàn)AR-V7和AR-V9通常在前列腺癌晚期患者中發(fā)生共表達，并且還發(fā)現(xiàn)，先前認為僅存在于AR-V7中的與可變剪切有關(guān)的外顯子，同樣存在于AR-V9 mRNA中。研究人員重新注釋了AR-V9 mRNA的結(jié)構(gòu)，并進一步明確了AR-V9 mRNA的高表達可作為預(yù)測前列腺癌對靶向藥物醋酸阿比特龍發(fā)生抗性的生物標志物。
實驗流程：
實驗結(jié)果
1. AR-V7和AR-V9在前列腺癌細胞共表達
AR典型外顯子1-8表達結(jié)果和預(yù)期的一樣，外顯子3下游部分高表達，包括CE3和CE5(圖1)。AR-V與AR mRNA相比缺少配體結(jié)合域(LBD)。
圖1 CPRC中AR基因結(jié)果
2. AR-V7和AR-V9 3’端外顯子結(jié)構(gòu)分析
三代測序完善了AR基因的外顯子結(jié)構(gòu)(圖3)，此外，不同的引物測序所得的外顯子信息完整性不同。
圖2 CPRC中不同AR亞型的基因結(jié)構(gòu)
3. AR-V7和AR-V9在CPRC共表達
圖3A是56位CPRC陽性病人轉(zhuǎn)移灶活檢結(jié)果。圖3B是12位接受阿比特龍或恩扎魯胺治療的病人的腫瘤循環(huán)細胞中AR-V7和AR-V9情況。結(jié)果表明，AR陽性病人AR調(diào)控及前列腺癌相關(guān)基因都有一定的表達。部分病人往往存在AR-V7和AR-V9共表達現(xiàn)象。
圖3 AR-V7和AR-V9在CPRC共表達
4. 外顯子CE3 siRNA抑制AR-V9蛋白表達
圖4A顯示不同的剪切方式形成了不同的AR變異體，但是AR-V7和AR-V9之間存在overlap。siRNA(CE3或CE5)轉(zhuǎn)染22Rv1和VcaP細胞，提取RNA后進行RT-PCR，圖4B結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染CE3 siRNA細胞的AR-V7和AR-V9表達量都有所降低，而CE5 siRNA只影響了細胞中AR-V9的表達量。轉(zhuǎn)染后細胞的免疫沉淀結(jié)果和RT-PCR結(jié)果一致。
圖4 AR-V7和AR-V9 3’UTR存在overlap
5. AR-V9激活并促進AR合成
慢病毒感染和細胞增殖實驗結(jié)果表明，AR-V9可促進CPRC細胞的AR非依賴性增殖，也就是說，如果在CPRC的循環(huán)腫瘤細胞中檢測到了AR-V9的話，那么這可能與患者對Enzalutamide存在耐藥性。
圖5 AR-V9作為AR的激活轉(zhuǎn)錄因子
2016年，派森諾生物在原有的PacBio RS II三代高通量測序儀基礎(chǔ)上，率先部署最新款PacBio Sequel測序儀，并已投入使用，助力全長轉(zhuǎn)錄組測序研究！
參考文獻
Kohli M, Ho Y, Hillman D W, et al. Androgen receptor variant AR-V9 is co-expressed with AR-V7 in prostate cancer metastases and predicts abiraterone resistance[J]. Clinical Cancer Research 2017.
