2020-12-14
單細(xì)胞測序已然成為學(xué)術(shù)界的新寵，將研究深入到組織內(nèi)部，解析組織的異質(zhì)性，不斷刷新人們對(duì)生命科學(xué)研究的認(rèn)知。單細(xì)胞測序通常需要新鮮樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，這給單細(xì)胞測序的應(yīng)用帶來了一定的挑戰(zhàn)。不少老師保存了長時(shí)間積攢的珍貴的臨床樣本，如果能夠針對(duì)這些凍存樣本進(jìn)行深入的異質(zhì)性研究，無疑具有重大意義。 小編將介紹一系列的如何利用凍存樣本進(jìn)行解析組織異質(zhì)性研究的高分文章案例，幫助研究者針對(duì)性地利用樣本資源進(jìn)行個(gè)性化的方案設(shè)計(jì)。今天，小編就為大家介紹一篇關(guān)于單細(xì)胞核測序研究凍存樣本的文章。 發(fā)表雜志：Nature Medicine 影響因子：36.13 發(fā)表時(shí)間：2020年1月 關(guān)鍵詞：腦發(fā)育，阿爾茲海默癥，TREM2，單細(xì)胞核測序 阿爾茨海默病（AD）是一種起病隱匿的進(jìn)行性發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。隨著人口老齡化的發(fā)展，AD患者數(shù)量急劇增加。目前對(duì)于阿爾茲海默癥的研究，已經(jīng)深入到多組學(xué)水平。前期研究發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞在大腦疾病中發(fā)揮重要功能，其主要通過細(xì)胞數(shù)目、細(xì)胞基因表達(dá)譜等多水平發(fā)揮功能。因此，針對(duì)大腦中的小膠質(zhì)細(xì)胞，尤其是其基因表達(dá)譜的研究，對(duì)于揭示AD發(fā)病機(jī)制具有重要意義。 作者首先針對(duì)野生型小鼠，AD小鼠，Trem2敲除小鼠，以及前兩者的雙突變小鼠各三只，取大腦組織進(jìn)行單細(xì)胞核測序，捕獲到73419個(gè)細(xì)胞核進(jìn)行細(xì)胞分群分析，共鑒定到10個(gè)細(xì)胞類群，5種細(xì)胞類型。非常值得注意的是，AD小鼠的小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量大大增加，并且星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量減少。因此，這兩類細(xì)胞首當(dāng)其沖地成為后續(xù)研究的重點(diǎn)關(guān)注對(duì)象。此外，雙突變體的細(xì)胞數(shù)量，與Trem 2-/-突變體以及野生型的數(shù)量相近，掩蓋了AD小鼠的異常表型，暗示AD產(chǎn)生依賴于TREM2。 為進(jìn)一步研究機(jī)制，作者挑選差異最大的小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)一步分析。各基因型小鼠的marker基因分析進(jìn)一步支持Trem2參與AD產(chǎn)生。此外，將小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)一步分群，根據(jù)基因表達(dá)譜分成4個(gè)sub-cluster。有趣的是，AD小鼠中sub-cluster1的細(xì)胞數(shù)量大大增加，而sub-cluter0的細(xì)胞數(shù)量大大減少，說明這兩個(gè)sub-cluster可能與AD產(chǎn)生具有更密切的關(guān)系。分析這兩個(gè)sub-cluster的marker基因，篩選到三個(gè)基因，這三個(gè)基因可能是參與AD形成的關(guān)鍵基因。 此外，作者對(duì)另外一種膠質(zhì)細(xì)胞，少突膠質(zhì)細(xì)胞及其祖細(xì)胞進(jìn)行了分析。少突膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)量沒有明顯差異，因此作者關(guān)注在AD小鼠的少突膠質(zhì)細(xì)胞及其祖細(xì)胞中特異高表達(dá)的基因，關(guān)注到了C4b和Serpina3這兩個(gè)基因，并通過免疫熒光進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。 隨后，作者對(duì)AD高風(fēng)險(xiǎn)病例10例，TREM2-CV 11例以及無AD病例11例的腦背外側(cè)前額葉皮質(zhì)區(qū)域，進(jìn)行單細(xì)胞核測序，共捕獲到66311個(gè)細(xì)胞核。同樣地，對(duì)單細(xì)胞核測序結(jié)果進(jìn)行細(xì)胞分群、marker基因鑒定、差異表達(dá)基因分析及其免疫熒光驗(yàn)證以及針對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞重新分群的分析，比較AD小鼠模型和AD病人的基因表達(dá)差異。 作者仍然是首先關(guān)注細(xì)胞數(shù)目，發(fā)現(xiàn)AD病人中星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目減少。進(jìn)一步地挑選星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行重新分群，marker基因鑒定等分析。針對(duì)細(xì)胞數(shù)目差異不顯著的少突膠質(zhì)細(xì)胞，特異的差異表達(dá)基因仍然是研究切入點(diǎn)。據(jù)此，作者篩選到了影響三類膠質(zhì)細(xì)胞的關(guān)鍵基因，通過對(duì)這些基因的功能及所在信號(hào)通路的分析，解析AD的發(fā)病機(jī)制。 此外，作者分析了大樣本的bulk RNA-seq分析，篩選到與單細(xì)胞測序結(jié)果一致的基因。分析了大樣本的不同TREM2突變類型的病例，比較兩者的基因表達(dá)譜，估算的特定細(xì)胞類群的數(shù)目和信號(hào)通路，分析不同類別突變類型影響不同AD進(jìn)展的分子機(jī)制。 總結(jié)來說，單細(xì)胞核測序與單細(xì)胞測序的分析方法、數(shù)據(jù)呈現(xiàn)方式以及能解決的生物學(xué)問題等多方面均沒有差別。當(dāng)我們獲得海量的單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)后，不妨可以試試像這篇文章的思路，挑選細(xì)胞數(shù)目存在差異的細(xì)胞，挑選已經(jīng)報(bào)道了參與某疾病的細(xì)胞，關(guān)注這些細(xì)胞的差異表達(dá)基因，揭示疾病發(fā)生機(jī)制。并通過大樣本的bulk RNAseq測序分析，有望獲得疾病類型、不同疾病進(jìn)展階段以及不同預(yù)后的診斷標(biāo)記物，為未來的臨床診斷提供理論依據(jù)。
