2020-11-23
導語
單細胞測序=高分文章？在一兩年前，大概確實如此。然而到了今天，研究者對此已經越來越心存懷疑。從一個具體的生物學問題出發，準備好精巧的實驗設計，加上個性化的分析方案，最終得出推陳出新的結論，已然成為單細胞測序的新方向。
今天，小編以一篇利用單細胞測序技術，解析附肢發育的轉錄圖譜的文章為例，帶領大家思考，我們是否能比作者做的更多，做的更好？
脊椎動物的附肢是一個及其復雜的器官，每一塊骨和肌肉的位置都被精密地組織在一起。附肢發育的機制研究是一個解析脊椎動物的器官發生分子機制研究的重要范例。作者取了胚胎發育的三個時期，HH25，HH29，HH31的三個樣本進行單細胞測序分析。結果顯示，在HH25時期，鑒定到間充質干細胞、骨骼祖細胞以及皮膚、肌肉、血液細胞；HH29時期，鑒定到間充質干細胞、遠端間充質干細胞、骨骼祖細胞以及指間細胞、非骨骼連接組織、皮膚、肌肉、血液、血管內皮、血管平滑肌細胞；HH31時期因為選取的組織區域較小，因此僅鑒定到間充質干細胞、遠端間充質干細胞、骨骼祖細胞以及指間細胞和皮膚細胞。針對不同的細胞類群，分別分析了其特異激活的信號通路以及高表達的marker基因，進一步驗證了附肢發育過程中不同的細胞類群。
針對17628個細胞的單細胞測序，作者獲得了17828個轉錄組。利用這些轉錄組數據，作者進行了WGCNA分析，通過篩選各個共表達基因，獲取附肢發育過程關鍵的候選基因列表。總體而言，WGCNA的共表達genemodule與不同sub-cluster密切相關。比如，HH29的sub-cluster5主要富集了module Green，sub-cluster16主要富集了module Pink。從功能角度看，module Green/sub-cluster5主要與有絲分裂有關，module Pink/sub-cluster16主要與G2/M transition有關，這與t-SNE分布圖上兩個sub-cluster的空間分布接近是吻合的。以上結果，非常合理，但是讀起來，似乎少了一點創新性。
作者將單細胞測序數據與一個已報道的根據不同腳趾以及趾間組織分別取樣的bulk RNA測序的結果進行聯合分析。在根據bulk RNA測序結果篩選了54個第三趾和第四趾特異表達的基因里，作者關注了7個在第四趾高表達的基因，這7個基因在單細胞測序的結果里，3個是module midnightblue的基因，4個是sub-cluster2的marker基因。據此，作者推斷，sub-cluster2是第四趾發育的祖細胞。針對其它的一些module，作者同樣地分析了一遍，小編在此不做贅述。
作者針對不同的基因進行了深入分析，但是忽略了細胞間的關系。單細胞測序在發育生物學中的應用，很重要的一個工具是擬時序分析。擬時序分析呈現一系列細胞的擬時間軸上的分布，分析不同細胞之間的演化狀態，并能篩選去命運轉換過程中特異表達的基因，這些基因可能就是決定細胞命運的關鍵基因。
根據HH29的t-SNE結果可見，趾間組織主要由sub-cluster2、6、12三個亞群構成。這三個亞群，可被挑選出來進行后續分析。根據bulk RNA測序的結果，可以挑選出在第四趾特異表達的基因，據此可篩選這些表達基因表達的sub-cluster。將依據不同方法篩選的sub-cluster進行擬時序分析，分析這些細胞的演化狀態，并篩選出處于中間狀態的細胞，解析第四趾的發育軌跡。這些細胞里高表達的基因，則可以作為決定趾的發育的關鍵候選基因，進行后續研究。
此文的作者非常幸運，之前有報道了他感興趣的第四趾的特定區域的bulk RNA測序的結果。在實際的研究中，很多工作都沒有可供參考的已發表結果。那么，我們又該如何進行科學研究工作呢？以這個case為例，空間轉錄組測序是一個非常好的解決方案。
空間轉錄組測序的HE染色圖片上，可以輕而易舉地篩選感興趣空間對應的spot，并查閱在這些spot里特異表達的基因。通過分析這些基因在單細胞測序結果里高表達的cluster、，即可判斷在感興趣的區域，聚集了哪些細胞類型。以這些細胞類型作為研究切入點，分析相近的cluster之間的細胞演化關系，以及關鍵演化狀態中的特異表達基因，可篩選到感興趣組織類型發育相關的關鍵基因，為后續研究奠定基礎。
總結來說，這篇文章描述了發育過程中的不同細胞類型，缺乏明確的生物學問題。樣本的設置，無論是時間維度還是生物學重復維度，都太少了。作者獲得了17628個轉錄組，將這些轉錄組進行了WGCNA的分析，忽略了不同轉錄組即細胞之間的相關性；而細胞間的相關性，恰是單細胞測序的一個重要解析點。作者雖然篩選了一些基因，但是對這些基因的功能，尚未進行嚴謹的生物學研究。
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