2020-11-19
關于NGS文庫質檢的事，上次我們聊了文庫片段方面 文庫知多少——NGS文庫質檢解析（點擊查看），今天我們來聊聊文庫濃度方面。
對于illumina 測序平臺，準確的文庫濃度是獲得高質量測序數據的前提，因為：
1、如果上機lane的濃度過低，則導致數據產出少，將不能獲得足夠的測序數據，需要補測以達到需要的數據量，增加了測序費用和測序周期。
2、如果上機lane的濃度過高，將產生低質量的測序數據，甚至會導致測序失敗。
此外，目前主流的illumina測序儀Novaseq 6000每張S4測序芯片可以產出至少3.2T的數據，而單個樣品需要的數據量遠遠小于一張芯片的產出，因此，通常將多個樣品混合到一起進行測序，后續再根據每個樣品建庫時用的index標簽來區分；混合到一起的各個樣品的產出，理論上與其物質的量占比成正比，舉個例子：假設只有A和B兩個樣品，物質的量各占50%，則產出100G數據時，理論上A有50G，B有50G；當A占90%，B占10%，產出100G數據時，理論上A為90G，B為10G。
由此可看出，準確可靠的文庫濃度一方面決定了一張測序芯片的產出，另一方面決定了混合文庫中各個子文庫的產出。明白了文庫濃度檢測的重要性，下面我們來聊聊幾種常見的文庫濃度檢測方法。
一、紫外吸收法
紫外吸收法的原理是：核苷、核苷酸、核酸的組成成分中都有嘌呤、嘧啶堿基，這些堿基都具有共軛雙鍵，在紫外光區的250-280nm處有強烈的光吸收作用，最大吸收值在260nm左右，因此可以利用核酸的紫外吸收性進行濃度定量。
采用紫外吸收法進行濃度定量的常見儀器有NanoDrop分光光度計（如圖1），NanoDrop分光光度計操作簡便，迅速，但缺點是無法區分DNA、RNA、降解核酸、游離核苷酸及其它雜質，此外，待測樣品的濃度小于100ng/ul時，檢測結果的變異度增大，可信度不高，因此，該儀器更推薦用于檢測提取后的DNA或者RNA的質量，通過比較A260/A280和A260/A230的比值判斷提取后核酸的純度。純RNA的A260/A280 ≥2.0，DNA的A260/A280 ≥1.8，當樣品中雜質含量較高時，比值下降，RNA和DNA的比值分別低于2.0和1.8時，建議純化除去雜質。
圖1
二、熒光染料法
熒光染料法的原理是：熒光染料與特異性的靶分子（DNA、RNA或者蛋白質）結合后發出的熒光強度比未結合前的熒光強度高許多，可以減少游離熒光對背景信號的干擾，且所產生的熒光強度與特異性靶分子的濃度成正比，這樣即使在雜質污染條件下，也不會受到干擾，從而得到可靠的濃度。
熒光染料法常用的儀器有Qubit（如圖2），通過使用不同的熒光染料，可以特異性地檢測雙鏈DNA、RNA或蛋白質，檢測靈敏度高且重復性好，雙鏈DNA濃度低至0.5ng/ul也只需1ul即可完成檢測。
圖2
三、實時熒光定量PCR法（qPCR法）
實時熒光定量PCR技術（qPCR法）是熒光檢測技術和PCR技術的結合，在PCR反應體系中加入熒光基團，通過實時監測整個PCR過程中熒光信號的變化情況，反映濃度的變化情況，最后通過已知濃度的標準曲線計算未知樣品的濃度。
qPCR儀器主流的品牌有Thermofisher、ROCHE、BIO-RAD。qPCR法涉及到PCR擴增過程，在PCR擴增時特異性的引物僅會定量兩端接頭連接完整的文庫（即可測序的文庫），可排除單端或雙端都不連接接頭的不可測序文庫的干擾，是目前業內進行文庫定量推薦的方法。
最后，小編再分享一些個人的經驗，由于熒光染料法無法區分單端或雙端都不連接接頭的不可測序文庫，得到的濃度可能偏高，因此qPCR法成為了文庫濃度定量最推薦的方法，因為該方法只會檢測兩端接頭連接完整的文庫，但是qPCR法也有其局限性，如果文庫中有抑制PCR擴增的雜質存在，qPCR法定量得到的濃度會偏低。因此，建議結合兩種方法的結果進行判斷，選擇最準確的文庫濃度。
相信不少老師對于濃度檢測也存在一些疑惑：為什么各家公司檢測的結果差異如此巨大？下面就這個情況小編來分享一些個人的想法。
濃度檢測的結果受儀器狀態、人員操作、試劑耗材等因素影響，其中儀器狀態因素不需過多考慮，重點考慮的因素是人員操作和試劑耗材。檢測濃度的移液體積都非常少，約1-5ul，因此非常考驗操作人員使用移液器的水平，結果偏離預期較大時，首先應安排重新檢測；試劑耗材也是一個重要的影響因素，下面我們以qPCR實驗的簡化模型作為例子說明，qPCR實驗未知樣品的濃度是通過已知濃度的標準品計算得出，不同廠商標準品的實際濃度與宣稱的有差異，以圖3作個簡單的說明，假設B廠商標準品B的濃度是真實的10nM，此時待測樣品濃度與標準品B對比，可得出待測樣品濃度為5nM；但如果我們將待測樣品與同樣宣稱濃度是10nM但實際濃度是5nM的標準品A對比，我們就會得出待測樣品濃度為10nM，這樣一看，只是標準品不同，結果卻相差了2倍。
圖3
最后，我們用一個表格來總結3種濃度檢測方式吧。
