2017-08-23
在類人猿和人類的進(jìn)化過程中，松弛素基因經(jīng)過復(fù)制，形成了兩個(gè)序列高度相似松弛素基因，RLN1和RLN2基因。高度同源的RLN1和RLN2基因的同步表達(dá)不利于對其進(jìn)行精準(zhǔn)描述。澳大利亞前列腺癌研究中心Colleen Nelson教授研究團(tuán)隊(duì)利用Pacbio SMRT和RNA-seq對LNCaP細(xì)胞系進(jìn)行測序，來解析RLN1和RLN2的變異體的表達(dá)。文中鑒定了一種新的融合轉(zhuǎn)錄本，其中包含有RLN1和RLN2基因，同時(shí)發(fā)現(xiàn)他們在正常組織和前列腺癌組織中都有表達(dá)。融合基因的鑒定提供了用以確定RLN1-RLN2融合基因和RLN1的單拷貝區(qū)域的信息。RLN1-RLN2融合基因和RLN1在LNCaP細(xì)胞中共表達(dá)，但是這兩個(gè)基因產(chǎn)物被雄激素負(fù)調(diào)控。這個(gè)發(fā)現(xiàn)對松弛素領(lǐng)域的研究進(jìn)行了更新，也激勵對RLN1和RLN2在PCa 細(xì)胞系中作用的進(jìn)一步研究。
將環(huán)狀一致性序列（CCSs）比對到RLN1-RLN2位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)CCSs能比對到已注釋的RLN1基因，卻不能比對到已注釋的RLN2基因。兩個(gè)較長的RLN2轉(zhuǎn)錄本的變異體和RLN1基因融合，形成了兩個(gè)融合基因RLN1-RLN2-1和RLN1-RLN2-2（圖1）。
圖1 利用SMRT測序識別LNCaP細(xì)胞中的RLN1-RLN2融合基因
新RLN1-RLN2融合基因包含RLN1和RLN2的部分核苷酸序列，并獲得了基因間區(qū)的新外顯子。較短的RLN1-RLN2-1融合基因轉(zhuǎn)錄為RLN2肽，不考慮對其做深入研究。較長的RLN1-RLN2-2融合基因預(yù)測是一個(gè)新RLN2異構(gòu)體，這個(gè)融合基因包含有可選擇的起始密碼子和新的外顯子（圖2）。新的RLN2異構(gòu)體包含有完整的RLN2的功能域（B-chain，C-肽和A-chain），但是丟失了整個(gè)的信號序列，這對于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體途徑中的分泌過程是必要的。
圖2 RLN1-RLN2-2融合編碼一個(gè)假定的沒有信號肽的RLN2異構(gòu)體。
RLN1-RLN2-2融合基因和已注釋的RLN1和RLN2基因有明顯的重疊區(qū)。利用BLAT工具和USCS基因組瀏覽器比對新融合基因，在RLN1-RLN2-2單拷貝區(qū)域設(shè)計(jì)qPCR引物。設(shè)計(jì)RLN1-RLN2-2融合基因的特異性正向引物，需跨越融合的新外顯子和下游的融合外顯子的結(jié)合位點(diǎn)。在RLN2和RLN1-RLN2-2融合基因的共有區(qū)域設(shè)計(jì)反向引物（圖3A）。同理設(shè)計(jì)RLN1的qPCR引物。為了檢測引物的特異性，用多四環(huán)素誘導(dǎo)的慢病毒載體轉(zhuǎn)染LNCaP細(xì)胞系，其編碼以注釋的RLN2為靶基因的shRNA（shRLN2）。對照是編碼非靶基因的shRNA（shNT）LNCaP細(xì)胞系。多四環(huán)素的處理，對shNT細(xì)胞系中RLN1-RLN2-2融合基因的表達(dá)沒有影響，但是在shRLN2細(xì)胞系中引起RLN1-RLN2-2融合基因的顯著減少（圖3B）。另外，多四環(huán)素處理減少了RLN1的表達(dá)，但是在shNT和shRLN1細(xì)胞系之間沒有差異，可以證明RLN1引物的特異性（圖3C）。
圖3 鑒定識別RLN1-RLN2-2融合和RLN1的單拷貝序列。
RLN1-RLN2-2融合基因和RLN1在轉(zhuǎn)錄本的同一鏈上有重疊區(qū)（圖1）。預(yù)測RLN1和RLN1-RLN2-2融合基因的表達(dá)有關(guān)聯(lián)。首先檢測RLN1在3個(gè)正常組織和7個(gè)PCa細(xì)胞系中的表達(dá)量。發(fā)現(xiàn)RLN1只在LNCaP細(xì)胞系中大量表達(dá)，但是在其他PCa細(xì)胞中，表達(dá)差異減少了80倍（圖4A）。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，RLN1-RLN2-2融合基因在LNCaP細(xì)胞系中高表達(dá)，在其他PCa細(xì)胞系中是低表達(dá)（圖4B）。利用 GeneAtlas芯片數(shù)據(jù)分析進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)前例腺組織中RLN1特異性表達(dá)（圖4C）。另外，使用TCGA公共的RNA-seq數(shù)據(jù)，研究正常組織和PCa組織樣本以確認(rèn)RLN1的表達(dá)是否受正常前列腺組織的限制，發(fā)現(xiàn)正常組織和PCa組織高表達(dá)RLN1（圖4D）。
圖4 RLN1和RLN1-RLN2-2融合的共表達(dá)及PCa細(xì)胞系中RLN1表達(dá)的不具代表性
用胎牛血清（CSS）代替雄激素培養(yǎng)LNCaP細(xì)胞系10天，發(fā)現(xiàn)缺少雄激素導(dǎo)致RLN1-RLN2-2融合基因水平保持穩(wěn)定增長（圖5A）。在缺少雄激素的情況下，RLN1的水平也比較高，但是和RLN1-RLN2-2融合基因相比，這種增長是微量的。 為了驗(yàn)證RLN1-RLN2-2融合基因的表達(dá)的增加是雄激素導(dǎo)致的，設(shè)計(jì)了相似的實(shí)驗(yàn)。將LNCaP細(xì)胞系先在CSS中培養(yǎng)2天，然后用雄激素處理2天。處理后的LNCaP細(xì)胞系中限制了RLN1-RLN2-2融合基因表達(dá)（圖5B）。雄激素處理細(xì)胞系和對照相比，雄激素抑制作用導(dǎo)致了RLN1-RLN2-2融合基因水平降低了60-75%。和RLN1-RLN2-2基因相反，雄激素的處理導(dǎo)致RLN1表達(dá)上調(diào)，表明雄激素對基因的逆調(diào)控作用（圖5C）。 為了確認(rèn)RLN1-RLN2-2和RLN1與雄激素的逆調(diào)控作用是由于雄激素的信號傳導(dǎo)作用，特定地使用多四環(huán)素抑制AR，誘導(dǎo)shRNA敲除（shAR）。在多環(huán)素誘導(dǎo)和非誘導(dǎo)細(xì)胞系中，對照細(xì)胞系（shNT）DHT處理抑制RLN1-RLN2-2融合（圖5D）。抑制作用在非誘導(dǎo)shAR細(xì)胞系中很明顯，但是多環(huán)素誘導(dǎo)AR敲除改善了這種抑制作用，證明雄性激素信號傳導(dǎo)下調(diào)RLN1-RLN2-2的水平（圖5D）。和RLN1-RLN2-2相反，RLN1的表達(dá)在DHT處理的對照細(xì)胞系中增加，但是這種增加是受AR敲除的抑制（圖5E）。
圖5 RLN1-RLN2-2和RLN1受雄激素的負(fù)調(diào)控作用。
文章目的是通過SMRT平臺對PCa LNCaP細(xì)胞系中全長RNA轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行測序，用以詳細(xì)解析RLN1，RLN2及它們的轉(zhuǎn)錄本變異體的表達(dá)，鑒定RLN1和RLN2的單拷貝序列，進(jìn)而對它們進(jìn)行更精準(zhǔn)的描述。研究發(fā)現(xiàn)了一種新的高表達(dá)的融合基因，包含有RLN1和RLN2基因，推測編碼一個(gè)RLN2異構(gòu)體，導(dǎo)致信號序列區(qū)域被改變，可能會改變細(xì)胞分泌方式。
參考文獻(xiàn)
Tevz G, McGrath S, Demeter R, et al. Identification of a novel fusion transcript between human relaxin-1 (RLN1) and human relaxin-2 (RLN2) in prostate cancer[J]. Molecular and cellular endocrinology, 2016, 420: 159-168.
