2020-10-26
2020年即將過去，2021年還會遠嗎？抓住2020年的小尾巴，蛋白組研究做起來~~~
小派此次整理了蛋白組10問10答——基礎版，幫助大家快速入門蛋白組，讓蛋白組給自己的科研之路助一臂之力。
Q1. 蛋白組的研究必要性你知道嗎？
A1. 蛋白質組(Proteome)的概念最先由Marc Wilkins提出，指由細胞或組織表達的所有蛋白質(protein)集合，此處劃重點，蛋白組是檢測的樣本內的累積蛋白量。
基因雖然是遺傳信息的源頭，而蛋白確實基因功能的執行者
蛋白本身的存在形式和活動規律，如蛋白間的互作、蛋白修飾和蛋白結構等問題，必須從蛋白組的角度研究才能解決
蛋白的變化在臨床上往往會作為病理研究的主要對象，同時也可作為疾病診斷的標志物以及對于藥物的篩選有重要意義
Q2. 蛋白組研究的常用手段有哪些？
A2. 根據目的的不同，蛋白組研究的常用技術手段也有較大差異。
雙向電泳技術（理想目的：將細胞（或組織）內所有蛋白質都分離開來）
質譜技術及一系列派生技術 （測蛋白質序列）
蛋白質互相作用研究：酵母雙雜交，細菌雙雜交，免疫共沉淀技術，pull-down，FRET,BiFC等
蛋白質定位：熒光標記技術，共聚焦熒光顯微鏡技術，免疫熒光，免疫化學等技術。
其中，通量最高，結果轉化最快，應用范圍最廣的技術手段要數質譜技術及一系列派生技術，通過質譜平臺，可以對樣本中的蛋白進行定性和定量分析，明確不同生長條件，不同生理狀態，不同樣本之間的蛋白表達差異。
Q3. 質譜技術及一系列派生技術包含哪些？
A3. shotgun蛋白定性檢測——檢測樣本中的蛋白質類型，最為基礎，入門款；
定量蛋白組檢測——揭示樣本中蛋白質種類和表達量，進階款；
修飾蛋白組檢測——研究樣本中某種修飾類型蛋白質種類和表達量，飛升款；
PRM（目標蛋白定量檢測）——對定量蛋白組結果中的目標蛋白進行驗證，必須款。
以上是基于質譜平臺所做的常見蛋白組研究技術。詳情可以點擊下方鏈接，了解每種技術的詳情和應用。還沒搞清楚蛋白該怎么研究？那是你還沒看過這篇總結（點擊查看）后面我們的討論也是針對質譜平臺進行蛋白組研究開展討論
Q4. 哪些樣本類型可以基于質譜平臺進行蛋白組研究?
A4. 原則上，所有含有蛋白的樣本都可以進行蛋白組質譜研究，只是不同樣本中的蛋白質量可能不同，對于蛋白量比較低的樣本，在做質譜檢測之前可能會涉及蛋白濃縮富集的環節。
Q5. 基于質譜平臺做蛋白組是否有物種限制？
A5. 基于質譜平臺進行蛋白組檢測，首先就是要進行蛋白的鑒定，此分析依賴于該物種的參考基因組中的蛋白數據庫，一般而言，需要有參考基因組的物種才能進行蛋白組研究，但是如果研究物種暫時沒有公開可用的參考基因組，可以使用近源物種的參考基因組或者本物種的轉錄組數據作為蛋白鑒定所需的數據庫。當然，由于物種之間存在差異，最優方法仍是使用本物種的參考基因組進行蛋白鑒定分析。
Q6. 目前蛋白組文章中經常出現ITRAQ和TMT到底是什么？我應該選擇哪一個？
A6. ITRAQ（Isobaric tag for relative and absolute quantitation）和TMT（Tandem Mass Tags）是定量蛋白組檢測中所用到的、不同生產商所生產的同位素標簽，目的是給樣本帶上標記，方便樣本可以進行混合一次上機，避免分批次上機引入的誤差。ITRAQ和TMT只是同位素標簽的數目不同，可以一次性標記的最多樣本數不同。ITRAQ和TMT分別是由美國AB SCIEX和Thermo公司研發，ITRAQ是4標和8標的，TMT是2、6、10、16標的，具體應該使用哪個一個品牌都可以，不需執著于一定要使用哪一品牌。根據文章中出現ITRAQ或TMT，我們只需明確該文章使用了標記定量蛋白組即可。
Q7. 對于標記定量蛋白組，在每個樣本帶上標簽后，會將所有肽段MIX混合后進行色譜分級，其目的是什么？
A7. 通過色譜分級，將所有肽段分離成多個復雜度相對更低的組分，每個組分依次上機，有利于后續質譜檢測出更多的物質。
Q8. 進行質譜檢測蛋白組的樣本應該如何處理、運輸和保存？
A8. 細胞、組織、蛋白溶液、菌體等樣品最好采用收集后液氮速凍，干冰運輸，對于SDS-PAGE條帶和2D點以及酶解好的肽段樣品直接常溫運輸即可，如果天氣較熱，路途較遠，也可以進行液氮速凍，干冰運輸。
Q9. 哪些樣本進行蛋白組研究需要去除高豐度蛋白的去除？
A9. 一般情況下，血清、血漿樣品中都會存在高豐度蛋白（白蛋白等免疫蛋白），如果是此類樣本，目前人/鼠等物種的血漿/血清樣本已有成熟試劑盒去除高豐度蛋白，但某些物種或樣本中的高豐度蛋白，如雞蛋清等樣本，尚無成熟方法高豐度蛋白的去除。高豐度蛋白的存在會導致其他蛋白的檢測結果。樣本是否存在高豐度蛋白可以通過SDS-page膠圖或者相關文獻明確。
Q10. 為什么有些差異表達基因在蛋白層面沒有相應的差異蛋白？
A10. 差異表達的基因，其研究層次是轉錄組（RNA）層面，差異表達的蛋白，其研究層次是蛋白組（蛋白質）層面，由于轉錄后調控、翻譯水平調控和翻譯后水平調控的存在，RNA表達水平和蛋白表達水平結果存在不一致性是一個公認的事實，通常相關性只有～0.5左右，甚至更低。
