2020-10-21
作為空間轉錄組的熱粉，小派已經帶大家進行過入門，文章解讀，分析流程解析的學習，今天咱們就來點更實際的，想要開展空間轉錄組，肯定會遇到各種各樣的問題，下面就以Q&A的形式，給大家捋捋咱們的空轉小疑惑：
Q1想要做空間轉錄組，那么什么樣本都可以去做空轉嗎？
A1對于哪些樣本可以做空間轉錄組，可以先參考官方信息，目前，10x 官方已經測試的樣本類型如下：
人類：大腦（小腦、大腦皮層、多形性腦膠質母細胞瘤），脊髓（正常），心臟（正常和心肌梗塞），腎臟（正常和腎炎），大腸（結直腸癌），肺（正常，乳頭狀腺癌）卵巢（腫瘤），乳腺（正常，浸潤性導管癌，浸潤性小葉癌），脾臟（炎癥），淋巴（正常，炎癥）等；
小鼠：大腦，心臟，小腸和大腸，胃，肝臟，腎，四頭肌，肺，睪丸，甲狀腺，胸腺，眼睛，舌頭，嗅球，脾臟等；
大鼠：腦，腎，心臟，嗅球等；
斑馬魚：幼體
最新的測試信息可以直接參考官網：https://support.10xgenomics.com/spatial-gene-expression/tissue-optimization/doc/specificatio ns-visium-spatial-gene-expression-optimized-tissues；
如果咱們的樣本不在測試行列內，則需要進行評估。
Q2做空轉的組織確定好了，組織準備保存方面有什么要注意的呢？
A2獲取新鮮組織后，要對組織進行一定的處理，處理和保存方法如下：
先冷凍后包埋法：新鮮組織樣本取下后要迅速用預冷的PBS溶液或生理鹽水進行沖洗，去除組織表面殘留，然后用干凈的吸水紙吸干液體，用預冷的鑷子將新鮮組織浸沒在異戊烷，組織速凍 1min 或直至組織完全冷凍(實際冷凍時間取決于組織形態及大小)，一旦冷凍，將組織轉移到一個預冷的 WHEATON CryoELITE 低溫冷凍瓶中，并放置在干冰上。接下來冷凍組織可放置在-80℃下長期保存或立即進行下一步冷凍組織OCT包埋。
包埋和冷凍同時進行法：某些非常柔軟的組織（比如胚胎等），失去液體的支撐就會改變其正常形態，對于這樣的組織可采取冷凍和包埋同時進行的方法。沒有異戊烷的條件下，可以采取包埋和冷凍同時進行的方法。
TIPS
冷凍包埋方法不僅僅局限于上述兩種方式，其他方法可以咨詢評估，樣本質檢合格，也可用于嘗試進行空間轉錄組實驗（詳細的樣本準備資料和視頻可以聯系銷售獲取）。
Q3直接液氮凍存的樣本，保存了很久，可以做空間轉錄組嗎？
A3液氮凍存會在組織表面產生冰晶，冰晶會影響后期切片的組織結構。保存時間久可能會有RNA的降解。這種情況，首先建議如果樣本可以重新獲得，最好是用預冷的異戊烷包埋重新準備。如果前期收集的樣本，后期無法重新獲得，則可以將樣本進行切片嘗試。一般先切10張切片進行RNA質控檢驗，如果質檢合格，可以對切片進行HE染色，染色結果如果顯示老師感興趣的區域組織結構完好，則可以進行后續實驗。如果結構破壞嚴重，則即使RNA質量完好，也無法進行后續實驗。
Q4空間轉錄組對于的組織大小有什么要求嗎？
A4空間轉錄組Visium芯片的捕獲面積為6.5mmX6.5mm，所以在選擇樣本前，首先確 認好最佳的取材位置及合理的組織大小，可以保證Visium芯片的有效利用率。因此對于樣本大小，和捕獲區域比較合適的最好，大于捕獲區域面積的樣本，可以考慮放在兩個捕獲區域。小于捕獲區域面積的樣本，很難做到一個區域放多個樣本，只能試做。
Q5空間轉錄組對于樣本個數有什么限制嗎，必須是4個樣本的倍數個嗎？
A5空間轉錄組的正式實驗，一個玻片有四個捕獲區域。一個玻片必須一起操作，所以未滿四個樣本仍然會消耗一個玻片，所以從成本上考慮，4個樣本或者4的倍數個樣本是最優的方案。正式實驗過程如下：
Q6空間轉錄組的前期需要進行預透化，會不會預透化的時候找不到最佳條件呢？
A6對于預透化，我們已針對很多個樣本進行了測試。樣本的最佳透化時間，其實是一個比較長的時間范圍，在那個范圍內都可以達到很好的mRNA釋放的效果。所以一般的組織經過預實驗摸索基本都可以找到最佳的透化時間。
Q7那前面說空間轉錄組最好是四個樣本一起做，這四個樣本，每個樣本都需要單獨進行預透化嗎？
A7通常情況下，正常樣本的最佳透化時間都是差不多的，所以如果四個樣本均是正常組織的樣本，只是處理略微不同，則可以選擇一個樣本進行預透化即可；但是對于疾病狀態下的樣本，最佳透化時間會差異比較大，如果是疾病狀態的樣本，建議每個樣本分別進行預透化實驗以摸索每個樣本的最佳透化時間。
Q8空間轉錄組的檢測是單細胞層面的嗎？
A8空間轉錄組的檢測不是單細胞層面的，官方的Visium芯片，一個玻片上有四個捕獲區域，如下圖，每個捕獲區域面積為6.5mmX6.5mm，每個面積內有5000個spot，每個spot內的細胞數會根據樣本類型有所不同，一般是十幾個或幾十個細胞。所以一般空間轉錄組文章中空轉都會搭配單細胞轉錄組數據進行聯合分析。
Q9空間轉錄組測序和單細胞轉錄組測序一起進行的話，每個空轉的樣本都需要搭配這個樣本的單細胞轉錄組嗎？
A9這個按照老師的實驗設計來。如果空轉的樣本來自四個病人，那么建議每個病人做一個單細胞。如果有幾個空轉的樣本來自一個病人的同一個組織，可以這幾個樣本配一個單細胞。
10空間轉錄組主要可以應用于哪些領域呢？
10空間轉錄組研究分析組織的空間位置信息，有助于揭示精確空間范圍內發生的信號傳導通路和細胞行為，解析目標生物學過程的更深層次的分子機制，多應用于醫學相關的研究方向：
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