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代謝組10問(wèn)10答——三

2020-09-23

前有“代謝組10問(wèn)10答（基礎(chǔ)版）（點(diǎn)擊查看）”，后有“代謝組10問(wèn)10答（進(jìn)階版）（點(diǎn)擊查看）”，今天我們迎來(lái)了第三，希望通過(guò)連續(xù)三期的問(wèn)答方式，讓更多的人對(duì)代謝組研究的了解更深入一步。

Q1、代謝組檢測(cè)閾值是多少，或者說(shuō)檢測(cè)代謝物的最低含量是多少？

不同檢測(cè)平臺(tái)的靈敏度是不同的，LC-MS靈敏度最高，可達(dá)到fM級(jí)。但是，由于不同物質(zhì)自身的化學(xué)性質(zhì)不同，從而導(dǎo)致質(zhì)譜的離子化效率、信號(hào)響應(yīng)強(qiáng)度都會(huì)有很大的差異。所以，物質(zhì)在代謝組研究檢測(cè)中的靈敏度跟自身的性質(zhì)有關(guān)。因此，相同含量的不同物質(zhì)，可能一個(gè)能檢測(cè)到，另一個(gè)檢測(cè)不到。

Q2、為什么通過(guò)其他技術(shù)手段檢測(cè)物質(zhì)A的含量明顯多于物質(zhì)B，但是在代謝組數(shù)據(jù)中，物質(zhì)B的信號(hào)強(qiáng)度明顯大于物質(zhì)A的信號(hào)強(qiáng)度？

誠(chéng)如上一題所說(shuō)，不同物質(zhì)的理化性質(zhì)是不同的，各自具有不同的分子結(jié)構(gòu)和性質(zhì)基團(tuán)，因此不同物質(zhì)在質(zhì)譜離子化效率、信號(hào)響應(yīng)強(qiáng)度等方面都可能是有較大的差異的，最后體現(xiàn)為不同物質(zhì)的質(zhì)譜檢測(cè)效率有所區(qū)別。因此，代謝組數(shù)據(jù)僅適用于同一物質(zhì)在不同狀態(tài)、不同組別間的比較，不適用于同一樣本內(nèi)部不同物質(zhì)之間量的比較。

Q3、實(shí)驗(yàn)可收集到的樣本量低于檢測(cè)公司的要求，是否還可以研究代謝組？

代謝組研究在上機(jī)檢測(cè)前，需要對(duì)樣本進(jìn)行前處理，進(jìn)行代謝物提取，如果起始樣本量就較少，那么提取后代謝物的量也會(huì)很少，上機(jī)溶液中每種代謝物的相對(duì)豐度則較低，對(duì)于質(zhì)譜檢測(cè)來(lái)說(shuō)，相對(duì)豐度極低的物質(zhì)則可能檢測(cè)不到，最終影響到檢測(cè)到的代謝物數(shù)量。但是相對(duì)豐度較高的，被成功檢測(cè)到的代謝物的結(jié)果還是有一定參考意義的。

Q4、是否可以專門(mén)針對(duì)XX物質(zhì)進(jìn)行靶向檢測(cè)？

首先需要對(duì)XX物質(zhì)進(jìn)行評(píng)估，是否具有相關(guān)的文獻(xiàn)通過(guò)質(zhì)譜平臺(tái)成功檢測(cè)該物質(zhì)，即方法學(xué)問(wèn)題。其次是該類型項(xiàng)目即使文獻(xiàn)有相應(yīng)的方法學(xué)，還需去查詢是否有可購(gòu)買的標(biāo)準(zhǔn)品及其貨期。待收到標(biāo)準(zhǔn)品后，即可進(jìn)行方法學(xué)試驗(yàn)，此過(guò)程可能需要不斷地調(diào)整參數(shù)，優(yōu)化條件，直至實(shí)際的方法學(xué)可以檢測(cè)出標(biāo)準(zhǔn)品完整合格譜圖。最后才是檢測(cè)待測(cè)樣本。如果需要進(jìn)行絕對(duì)定量，還需使用標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。

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Q5、是否可以專門(mén)針對(duì)XX，YY，ZZ物質(zhì)進(jìn)行靶向檢測(cè)？

除了上述第四個(gè)問(wèn)題的答案中所需要考慮的問(wèn)題以外，還有一點(diǎn)需要明確，即不同的物質(zhì)的本身化學(xué)性質(zhì)是不同的，對(duì)應(yīng)的適合掃描模式（正離子掃描模式/負(fù)離子掃描模式）可能不同，其次是不同的物質(zhì)可能存在保留時(shí)間接近或者互相干擾影響的情況，導(dǎo)致他們不能在相同的檢測(cè)條件下同時(shí)檢測(cè)到。所以可根據(jù)第一次的結(jié)果進(jìn)一步?jīng)Q定是否需要部分物質(zhì)單獨(dú)檢測(cè)。總體上來(lái)說(shuō)，多次上機(jī)分別檢測(cè)成本比多種物質(zhì)一次上機(jī)檢測(cè)會(huì)有所提高。

Q6、GC-MS檢測(cè)和固相微萃取GC-MS檢測(cè)的區(qū)別？

GC-MS檢測(cè)一般是指使用氣相色譜儀和質(zhì)譜儀聯(lián)用檢測(cè)代謝物。氣相色譜僅適用于沸點(diǎn)低、熱穩(wěn)定性好的小分子物質(zhì)的分離分析，對(duì)沸點(diǎn)高、揮發(fā)性低、熱穩(wěn)定性差、極性強(qiáng)甚至極易揮發(fā)的物質(zhì)往往不能直接進(jìn)樣分析。生物樣本中含有大量的羥基、胺基、羧基、巰基等官能團(tuán)的物質(zhì)信息，因此采用適當(dāng)?shù)难苌幚矸椒▽?duì)于樣品的分離分析往往起著十分重要的作用。樣品的衍生化方法的好處有：

1、將一些不適合氣相色譜分析的物質(zhì)進(jìn)行適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)處理轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的揮發(fā)性衍生物，可以擴(kuò)大氣相色譜的物質(zhì)檢測(cè)范圍；

2、改變同分異構(gòu)化合物的色譜性能，提高和改善樣品的峰形和分離度，克服載體、柱壁對(duì)高極性、低揮發(fā)樣品的吸附。甚至通過(guò)特殊的衍生方法，分離手性化合物；

3、改善待測(cè)物質(zhì)的熱穩(wěn)定性，以提高檢測(cè)的靈敏度；

4、改善待測(cè)物質(zhì)的質(zhì)譜行為，有利于鑒定化合物的結(jié)構(gòu)。

一般GC-MS多用于研究初生代謝物。固相微萃取GC-MS指的是對(duì)于樣本中的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行萃取后的檢測(cè)，重點(diǎn)在于檢測(cè)揮發(fā)性物質(zhì)。主要過(guò)程是對(duì)頂空瓶中的氣體進(jìn)行抽提的時(shí)候采用涂有固定相的熔融石英纖維來(lái)進(jìn)行吸附、富集，然后再解吸，最后打入氣相色譜質(zhì)譜儀器中進(jìn)行分離分析；從而進(jìn)行一些揮發(fā)性或者氣味物質(zhì)的檢測(cè)的原理。固相微萃取技術(shù)主要用于氣體，液體或者固體樣本中揮發(fā)性組分或者半揮發(fā)性組分，氣味物質(zhì)，香味物質(zhì)的檢測(cè)。

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Q7組織和細(xì)胞樣本在收集時(shí)注意事項(xiàng)的不同？

因?yàn)榉前邢虼x組測(cè)到的代謝物都是相對(duì)含量，因此對(duì)于檢測(cè)的樣本起始量會(huì)要求每個(gè)樣本是基本一致的。檢測(cè)公司在接收到項(xiàng)目樣本時(shí)，對(duì)于組織樣本，會(huì)對(duì)每個(gè)樣本進(jìn)行稱量，取等重量的適量樣本進(jìn)行后續(xù)的前處理；而細(xì)胞樣本，因?yàn)榧?xì)胞樣本是離心棄上清后收集細(xì)胞沉淀后寄送檢測(cè)公司，公司實(shí)驗(yàn)室收到的細(xì)胞沉淀樣本，量較少，難以像組織樣本那樣進(jìn)行稱重，因此需要客戶在送樣前端就收集等數(shù)量的細(xì)胞，并注明每個(gè)樣本的細(xì)胞數(shù)目，然后進(jìn)行寄送。

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Q8、做代謝組研究每組生物學(xué)重復(fù)數(shù)一定要相同嗎？

每組樣本的生物學(xué)重復(fù)數(shù)目不一定要相同，但最好不要相差太多，差別不要超過(guò)三分之二即可。在一定程度上，生物學(xué)重復(fù)數(shù)足夠比生物學(xué)重復(fù)一樣更重要。

Q9、代謝組數(shù)據(jù)分析完成后，按照VIP>1，P<0.05篩選不到差異代謝物怎么辦？

如果利用常用的篩選標(biāo)準(zhǔn)（VIP＞1和P＜0.05）沒(méi)有找到差異代謝物，首先可以將篩選閾值放寬，如VIP＞1和P＜0. 1。如果還是沒(méi)有篩選出差異代謝物，那么可以對(duì)檢測(cè)到的物質(zhì)進(jìn)行單維統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，如FC>1.5和P＜0.05，通過(guò)每單個(gè)代謝物組間樣本的表達(dá)值比較分析差異代謝物，并用火山圖展現(xiàn)。

Q10、檢測(cè)到的代謝物中存在部分物質(zhì)沒(méi)有KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)的ID號(hào)是怎么回事？

很多代謝物在KEGG 中沒(méi)有對(duì)應(yīng)的ID號(hào)，屬于正常，KEGG并沒(méi)有把所有的小分子代謝物都囊括進(jìn)去，因此后續(xù)的差異代謝物通路富集分析主要是針對(duì)差異代謝物中有對(duì)應(yīng)的KEGG ID的物質(zhì)進(jìn)行的。

以上就是我們代謝組10問(wèn)10答（三）的全部?jī)?nèi)容，代謝組10問(wèn)10答為許多老師同學(xué)研究代謝組打好了基礎(chǔ)，針對(duì)代謝組檢測(cè)完成后如何看懂分析報(bào)告，小派也是在之前就整理好了“圖說(shuō)代謝組”報(bào)告解讀，感興趣的老師請(qǐng)戳“看不懂代謝組結(jié)果？不存在的”，圖文并茂，帶領(lǐng)大家攻克代謝組報(bào)告看不懂的問(wèn)題。

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