2020-09-22
最近有很多老師咨詢關于植物性別決定機制研究的項目，今天小編就結合南京林業大學尹老師團隊發表在BioRxiv的研究成果（https://doi.org/10.1101/2020.03.15.993022），給大家進行文獻解讀和該類型項目研究思路的總結。
摘要
植物的性別決定系統和性染色體相對來說在演化史比較“年輕”。本文中，作者發現一個完全雌雄異株的林木美洲黑楊（Populus deltoides）處于性染色體形成的早期階段，其中雌株和雄株的性別在遺傳上分別由兩小段與X或Y物理連鎖的序列所決定。有趣的是，有兩個Y基因在對應的X染色體上丟失了。其中一個基因產生的siRNA通過RNA指導的DNA甲基化和siRNA引導的mRNA剪切來阻斷一個對于雌性結構發育至關重要的基因的表達，從而達到抑制雌性結構發育的作用。而另外一個基因能夠產生長鏈非編碼RNA（lncRNA）轉錄本，這些lncRNA轉錄本在雄性中會消耗一些特異作用于雄蕊發育抑制的miRNAs。擬南芥中的遺傳轉化試驗顯示這兩個基因能夠分布獨立并且拮抗地影響雌蕊和雄蕊的發育。因此，楊樹中的性別決定系統為開花植物雌雄異株早期演化的研究提供了一個平臺，其中兩個具有聯合效應的性別決定基因比較偏向于緊密連鎖。
項目背景
● 性別決定是植物繁殖、發育與進化中的一個有趣的研究方向。大多數開花植物都是“兩性同體棵”，只有約10%的被子植物能開單性花（雄花和雌花在同一植株（雌雄同株），或不同植株（雌雄異株））。
● 雌雄異株（dioecism）在被子植物不同支系中獨立演化出多次，近年來在蘆筍（asparagus；雌性抑制基因SOFF，雄性促進基因aspTDF1）和獼猴桃（kiwifruit；雌性抑制基因SyGI，雄性促進基因FrBy）中的研究顯示，該繁育系統由兩性同體演化而來，其中Y染色體上完全連鎖的兩個基因相互獨立、卻又互相拮抗地作用于雌性和雄性發育。
● 除了雙基因系統之外，單基因控制的雌雄異株也存在。在玉米（maize）和甜瓜（melon）中，人為設計出了該系統；而在柿子（persimmon）中則是天然演化出了單基因控制系統，柿子Y染色體上的假基因OGI通過抑制常染色體上的旁系同源基因MeGI來作用于雄花的特化。
實驗材料與方法
1、樣品選取：
1）Denovo：選取一株雌性P. deltoides及其雄性F2代個體進行從頭測序；
2）美洲黑楊GWAS：選取無親緣關系雌株49， 雄株46；
3）轉錄組測序：采集9個時期（6月~1月），采集花蕾部分進行轉錄組測序，每個時期3個重復（其中花藥發育早期（T1~T5）,采集的帶鱗片花芽，（T5~T9）采集去鱗片花芽）。
2、方法思路：
結果解讀
01、性別決定位點的定位和X、Y單倍型的重建
圖1美洲黑楊第19號染色體單倍體的重建
本文對一株雌性美洲黑楊以及其雄性子代進行了測序、組裝，雌株基因組大小431Mb，contig N50長1.4Mb；雄性基因組大小414Mb，contig N50長2.8Mb。利用SSR標記將性別決定位點定位到了19號染色體上端粒與N362標記之間的299kb基因組區域上，作者將其定義為性別連鎖區域（SLR ，sex-linked region）（Fig 1A）。另外，由于雄株是雌株的直系后代，因此雄株XY染色體的X是來自于雌株。作者進一步通過SNP分型，分別構建了雄株的X和Y單倍體（Fig 1B）。通過比較X和Y單倍型的SLR區域，作者發現Y染色體上存在一長一短兩個半合子區段，并通過PCR驗證了雄性中的半合子區段（Fig 1C、D）。
02、性別決定基因的鑒定
為了進一步的鑒定性別決定基因，作者基于49棵雌株和46棵雄株的SNP數據進行了GWAS分析。
圖2 美洲黑楊性別GWAS分析的曼哈頓圖
利用雌株基因組作為reference，作者鑒定到了435個SNP存在雌株純合、雄株雜合的基因型（SEMS），其中315個SEMSs存在于三個SLR基因中，分別是TCP、CLC和MET1（Fig 2A）。剩余的SEMSs中，78個位于一個叫做FERR基因位點上，該位點雖然同在19號染色體上，但是屬于擬常染色體（pseudo-autosomal）。至于剩下的那些SEMSs均分布于常染色體上。由于使用的是雌性基因組作為參考序列，可能會將來自Y連鎖區域的read比對到X染色體的其它同源區域，從而造成假陽性的SEMS。通過進一步利用SLR-Y作為參考基因組，發現所有常染色體上SEMS全部消除不見（Fig 2C）。另外，采用read coverage，mapping基因組上只在一個性別中存在，而在另一個性別中確實的基因組區域，結果發現以SLR-X作為reference沒有鑒定到任何結果，而以SLR-Y作為reference則鑒定到了與之前一致的半合子區段區域（Fig 2D）。而在其中長的半合子區段含有兩個基因，分別是FERR-R和MmS。
03、候選性別決定基因的表達
圖3 基因表達水平的比較
為了進一步確認上文所鑒定到的候選基因，作者定量了這些基因在楊樹雌花和雄花發育過程中的表達水平。結果發現，TCP、CLC和MET1基因在雌、雄花發育過程中均有表達，且沒有明顯的偏向性。而FERR只在雌花中表達，FERR-R和MmS基因只在雄花中表達。由于FERR基因處于擬常染色體區域，而MmS則處于Y染色體的半合子區域，因此作者推測這兩個基因可能作用于楊樹的性別決定。
04、FERR-R是一種雌性化抑制基因，產生siRNAs抑制FERR的功能
序列比對顯示FERR-R基因與FERR基因序列相似性較高，在啟動子和外顯子的大部分區域存在序列同源（Fig 4A）。鏈特異性lncRNA和small RNA測序數據顯示，FERR-R基因轉錄成一條長的轉錄本，然后會形成小的干擾RNAs，即siRNAs（Fig 4B）。并且由FERR-R基因產生的siRNA可以指導FERR基因啟動子、5’-UTR以及第一個外顯子和內含子上的DNA甲基化（Fig 4B）。亞硫酸氫鹽測序顯示FERR基因位點這些區域上的DNA甲基化只是特異性的在雄株中存在（Fig 4B）。此外，FERR-R基因產生的siRNA還能夠靶向FERR基因的三個外顯子，表明FERR-R基因可能還會參與siRNA引導的FERR基因轉錄本剪切，作者進一步通過瞬間表達試驗驗證了這一點（Fig 4C）。結合上文對于FERR基因在雌雄花中的表達分析，以及在擬南芥中的過表達試驗（Fig 5A），作者推測FERR基因作用于促進雌性器官發育，而雄株中特有的FERR-R基因則作用于FERR基因功能的抑制。
圖4 FERR-R基因起源及及其功能分析
05、MmS基因位點降低miRNA水平，促進雄性
生信分析顯示MmS的轉錄本能夠結合多個miRNA（Fig 6A）。qRT顯示MmS基因在雄花不同發育時期持續表達（Fig 3C）。作者推測MmS基因通過結合多個miRNAs，從而使得雄株中的miRNAs相比于雌株中的更少，也阻斷了雄株中這些miRNA對于其靶基因的抑制，而這些靶基因可能作用于促進雄性器官發育。楊樹MmS基因在擬南芥中的過表達試驗顯示其能夠增加擬南芥的雄蕊，但不影響雌蕊的發育（Fig 5B）
圖5 轉擬南芥的表型
06、性別決定模型推斷
綜上，作者提出了美洲黑楊中的性別決定模型。結果如下：
結果與討論
1. 楊樹雌雄異型發育過程中可能有許多基因起作用，但FERR-R和MmS似乎是決定楊樹雌雄異型的上游基因；
2. 包括哺乳動物、鳥類和果蠅在內的許多Y染色體的一個顯著特征是沒有交叉，有時會導致出現在X染色體(以及Y染色體祖先)上的大量基因丟失，這一過程被稱為基因退化。每周黑楊的性別決定基因似乎也在一個非重組區域，但它在物理上比剛才提到的動物案例要小得多，甚至比獼猴桃和蘆筍中的小區域還要小。我們的研究結果揭示了美洲黑楊兩個性別決定基因的區域不會重組的原因，同時也說明了有兩種不同的途徑可以阻止植物Y-和X-連接區域之間的重組。
3. 該研究表明，在楊樹中，FERR-R的功能涉及到RNAi和DNA甲基化過程，而MmS是第一個報道在雌雄異株植物中觸發性別分離的miRNA海綿基因。由于許多miRNA家族在所有主要植物譜系中進化保守，因此MmS基因可能對楊樹以外的植物雄性器官的形成具有重要意義；
4. 在世界上許多地區，楊樹是主要的景觀，也是重要的纖維和燃料的商業來源。性別決定基因的獨立功能使我們可以通過基因編輯分別阻斷雌性楊樹和雄性楊樹的雌蕊和雄蕊發育。本研究為減少有性繁殖的能量消耗，解決雌性楊樹的種子毛和雄性楊樹的花粉對空氣造成的嚴重污染提供了修飾基因。
該研究不管從實驗設計還是結果驗證都給了我們對于植物性別決定機制的研究提供了一種很好的思路。如果大家也對植物性別研究有興趣，歡迎和我們一起探討，可在文末留言或者郵件交流（[email protected]）。下面是動植物產品線的產品類型，如果對其他產品比較感興趣的，也可以郵箱反饋我們，后續我們一一為大家安排
