2020-09-11
相信不少小伙伴都遇到過這樣的疑惑：收到一份轉錄組測序結果，辛辛苦苦查找文獻，挖掘關鍵基因信息，眼看一篇高大上的文章即將誕生，卻卡在了進行qPCR驗證這最后一步：我關注的RNA序列在哪里？沒有序列信息我要怎么設計引物做熒光定量PCR呢？
莫慌，我們整理了派森諾各種常規轉錄測序產品的RNA序列信息，下面就一起來看看吧！
1、有參轉錄組
有參考基因組的轉錄組項目在進行分析時，我們是將測序reads與參考基因組進行比對，根據比對結果進行基因定量分析，進而進行差異分析的。從分析方法就可以發現，有參轉錄組的基因信息來自參考基因組，因此基因序列也是來自對應的數據庫。
那么，我們如何從數據庫中查找目標基因序列呢？我們整理了最常規的兩大數據庫：Ensembl和NCBI的基因序列查找方法，如果您的基因組也是來自這兩個數據庫，可點擊查看
2、無參轉錄組
無參考基因組的轉錄組項目在進行分析時，我們首先要基于測序結果拼接出一個“基因集”，并對其進行注釋，再將測序reads比對到這個基因集上，進而進行表達量分析和表達差異分析。
具體而言，我們首先利用Trinity軟件對高質量的測序reads進行從頭拼接，得到轉錄本序列，再對轉錄本進行聚類，挑選最長的轉錄本作為Unigene。Unigene的序列存放路徑：\report\result\1_RNASeq_Pretreat\Assembly
另外，對于Unigene序列，我們使用Transdecoder軟件對其進行ORF（開放閱讀框）預測，從而得到CDS和蛋白序列，存放路徑：\report\result\6_Structure\ORF
3、LncRNA
LncRNA為片段長度大于200nt的長鏈非編碼RNA。分析時，我們用Stringtie軟件利用Hisat2的比對結果來組裝轉錄本，在將鏈方向不確定的轉錄本去除之后，在剩下的組裝轉錄本集合中進行LncRNA的篩選，獲得候選LncRNA。然后我們利用三種軟件：PLEK、CNCI、Pfamscan，對這些候選LncRNA進行編碼潛能預測，三種軟件均判定為沒有編碼潛能的新轉錄本是高可信度LncRNA，可用于后續分析。
LncRNA序列存放路徑：\report\result\LncRNA\1_Novel_LncRNA
4、CircRNA
CircRNA是一類特殊的非編碼RNA分子，與傳統的線性RNA（linear RNA，含5’和3’末端）不同，CircRNA分子呈封閉環狀結構，其首尾相連的“接頭”位置的序列由于來自相隔較遠的外顯子區域，直接比對基因組時存在大片段的缺口。利用這一特點，我們鑒定CircRNA時首先篩選未比對上參考基因組的測序reads，再截取兩端20bp作為Anchors序列再次比對到基因組上，用于檢測CircRNA。
CircRNA序列存放路徑：\report\result\CircRNA\1_CircRNA_Prediction
5、miRNA
miRNA是一類長度在18-36nt之間的短鏈非編碼RNA，由于其序列較短，我們對它的獲取與鑒定是一般是基于一些miRNA數據庫，如miRBase進行的。
miRBase (http://www.mirbase.org/）是由曼徹斯特大學的研究人員開發的一個在線的miRNA數據庫，該數據庫中收錄了來自200多個物種、接近4萬個miRNA的信息，是最全面的miRNA數據庫。
對于被miRBase收錄的物種，我們分析時會下載該物種miRNA的前體和成熟體序列，然后將去重后的測序reads與其進行比對，從而對測到的miRNA進行注釋。對于這種miRNA測序項目，最簡單的獲取序列方式就是從miRBase中下載所有物種的miRNA序列，從中搜索目標miRNA的ID即可：
對于未被miRBase收錄的物種，我們將去重后的測序reads與數據庫中所有動物（或植物）的成熟miRNA序列進行比對，從中篩選保守miRNA。
得到的保守miRNA序列存放路徑：\Results\03_Annotation\miRNA
看到這里各位可能已經發現了，無論是哪一種RNA，似乎所有的序列文件都是以.fasta或.fa為后綴的，這是什么格式呢？我們應該用什么軟件打開呢？
在生物信息學中，FASTA格式（又稱為Pearson格式），是一種基于文本用于表示核苷酸序列或氨基酸序列的格式，可用文本編輯軟件打開，如UltraEdit 、EditPlus等軟件，系統自帶的記事本（txt）工具也可以。然后利用搜索功能查找序列ID，就可以輕松找到對應的序列啦！
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