2020-09-08
哈嘍，又見面啦！BSA項(xiàng)目得到了候選區(qū)間，后續(xù)如何縮小候選區(qū)間，如何對候選基因進(jìn)行驗(yàn)證呢？
今天小編就選取了幾篇典型的BSA文章為大家進(jìn)行驗(yàn)證方法的總結(jié)。
該文獻(xiàn)研究的是玉米籽粒大小的性狀，該項(xiàng)目bsa選取了極端表型植株共100株（野生型與突變型混池各50株）進(jìn)行測序，采用△snp-Index進(jìn)行分析，最終定位區(qū)間為7號染色體上0~2M的區(qū)間，包含64個(gè)基因。通過分析突變類型，找到了8號染色體有一個(gè)snp（在Zm00001d018624的第8個(gè)外顯子上）發(fā)現(xiàn)突變，導(dǎo)致提前出現(xiàn)終止密碼子，轉(zhuǎn)錄水平顯著降低。并通過構(gòu)建突變體的BC1F1群體，對候選區(qū)間進(jìn)行了進(jìn)一步縮小與確認(rèn)。
候選基因已經(jīng)確定了，如何驗(yàn)證呢?本文采用了多種方式對這一基因進(jìn)行了驗(yàn)證。
驗(yàn)證方法1：突變數(shù)據(jù)庫反向篩選
通過在突變數(shù)據(jù)庫的篩選，找到了2個(gè)產(chǎn)生相同性狀的突變類型的突變株，將這些基因克隆，其中vks1-2等位基因是由Zm00001d018624第12個(gè)內(nèi)含子的剪接受體位點(diǎn)突變引起的，導(dǎo)致該內(nèi)含子的RNA剪接缺陷。vks1-3等位基因來自于Zm00001d018624的59未翻譯區(qū)(UTR)的Mu插入。將vks1-2自花授粉后子代發(fā)生性狀分離，種子中觀察到vks1-1的類似表型。vks1-3種子也遠(yuǎn)小于野生型(W22)，但在純合vks1-3穗上沒有明顯的種子大小變異，說明vks1表型部分依賴于遺傳背景。為了進(jìn)行等位性檢驗(yàn)，我們在純合子vks1-1和雜合子vks1-2/+植株間進(jìn)行雜交。得到的穗與vks1和野生型種子的分離比例接近1:1。
驗(yàn)證方法2：CRISPR/CAS9編輯技術(shù)
我們利用CRISPR/CAS9基因編輯技術(shù)，產(chǎn)生更多的vks1零等位基因。gRNA被設(shè)計(jì)用于靶向Zm00001d018624的第8個(gè)外顯子。得到3個(gè)C缺失、T插入和127-bp缺失的獨(dú)立轉(zhuǎn)基因株系，分別命名為vks1-4、vks1-5和vks1-6。自花授粉的vks1-4/+穗(作為這些CRISPR/ cas9誘導(dǎo)的無突變體的代表)也分離出了不同大小的小種子，如圖invks1-1和vks1-2所示。因此，Zm00001d018624是vks1表型的基因。
本文中，作者結(jié)合傳統(tǒng)基因定位方法和BSA法，利用155個(gè)F6代重組自交系個(gè)體，定位了IL52的霜霉病與白粉病抗性候選基因，并揭示了兩者之間的連鎖關(guān)系。
從155個(gè)RILS中選取16株抗病，20株感病材料混池測序后，做BSA定位分析，結(jié)果定位到5號染色體23.21-25.70 Mb的2.49M區(qū)間內(nèi)，區(qū)間內(nèi)包含27個(gè)△SNPindex = 1的SNP位點(diǎn)，其中非同義突變位點(diǎn)3個(gè)，3’UTR位點(diǎn)1個(gè)，分布在4個(gè)基因上。
通過連鎖圖譜和RILS表型數(shù)據(jù)，PM基因被定位在InDel73 (23.68 Mb) 和InDel82 (24.94 Mb)之間，與BSA結(jié)果相符。后基于BSA結(jié)果開發(fā)的Indel、SNP、SSR分子標(biāo)記與193個(gè)F2個(gè)體表型綜合分析，pm基因被定位到17ID185和17ID211之間, 遺傳距離 0.5 cM，物理距離468 kb (24,550,703-25,018,946 bp)，區(qū)間內(nèi)包含3個(gè)基因。同時(shí)發(fā)現(xiàn)基因Csa5M622830.1的3’UTR上的 SNP6，與PM完全連鎖。
該文獻(xiàn)BSA定位未取得較好的區(qū)間定位結(jié)果，但卻為我們提供了一種新的候選基因確定的思路。
通過SNP和indel call，在MF-和MSbulk之間確定了2,594,935個(gè)SNP和405,428個(gè)indel。為了繪制雄性不育圖譜，應(yīng)用ED算法測量等位基因分離，并根據(jù)兩大群體間的snp和indels確定連接基因組位點(diǎn)。通常，ED在統(tǒng)計(jì)上顯著的峰值被認(rèn)為是一個(gè)候選范圍。然而，在我們的研究中，12條染色體都沒有發(fā)現(xiàn)明顯的峰。為了克服上述問題，我們采用了更嚴(yán)格的過濾，規(guī)則如下:(1)ED值必須大于0.5;(2) SNP必須引起非同義突變;(3) indel必須導(dǎo)致移碼突變。最后，9個(gè)snp和4個(gè)indels通過篩選，發(fā)現(xiàn)它們位于6條染色體上的12個(gè)注釋基因上，被認(rèn)為是mcs-1位點(diǎn)的候選基因。
候選基因選定了，該文獻(xiàn)老師采用的是根據(jù)已有文獻(xiàn)報(bào)道的相關(guān)基因，鎖定了最終的候選基因，為了驗(yàn)證這一基因，老師開發(fā)了indel標(biāo)記，利用兩個(gè)群體NILs群體驗(yàn)證了indel-12標(biāo)記與雄性不育性狀的共混關(guān)系，結(jié)果如下圖所示，表明在驗(yàn)證群體中，msc-1基因組呈現(xiàn)完全的共分離現(xiàn)象，表明Capana02g002096可能是msc-1基因座的強(qiáng)大候選基因。
篇幅有限，小編就不多贅述了，總結(jié)下來。
當(dāng)候選區(qū)間較大時(shí)，縮小候選區(qū)間的方法如下：
1、構(gòu)建遺傳圖譜，結(jié)合表型數(shù)據(jù)，采用QTL分析進(jìn)行定位，一般選取與BSA分析的交集作為候選區(qū)間；
2、開發(fā)分子標(biāo)記，通過驗(yàn)證群體性狀與分子標(biāo)記的一致性縮小候選區(qū)間；
3、結(jié)合已經(jīng)報(bào)道的性狀相關(guān)基因或者相關(guān)突變體庫，鎖定候選基因；
4、結(jié)合轉(zhuǎn)錄組的相關(guān)基因表達(dá)水平分析選取具有明顯表達(dá)水平差異的基因作為候選基因。
候選基因主要的驗(yàn)證方法有：
1、將候選SNPs轉(zhuǎn)化為CAPs或者indel等標(biāo)記進(jìn)行驗(yàn)證；
2、基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的差異表達(dá)分析，看基因是否有顯著表達(dá)差異；
3、功能缺失型實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，如CRISPR、基因敲除，過表達(dá)等；
4、RT-PCR驗(yàn)證候選基因的表達(dá)。
好啦，BSA定位后續(xù)分析方法總結(jié)就到這啦，不知道老師們有沒有學(xué)會(huì)呢？其實(shí)從以上文章大家應(yīng)該也能發(fā)現(xiàn)，BSA項(xiàng)目中，定位得到候選區(qū)間只是故事的開始，候選基因的確定及基因功能的驗(yàn)證才是文章畫龍點(diǎn)睛的那一筆，研究者們每一篇文章的背后，都是固有思維與大開腦洞的碰撞，也許這就是科學(xué)的魅力吧！
參考文獻(xiàn)：
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