2020-09-03
在“困難樣本RNA提取的技能你get到了嗎？”文章中，我們對RNA提取原則和原理做了簡單的介紹，并對部分困難樣本進行了簡短的總結和結果展示。
時間已經過去了兩個月，在此期間不斷有新接觸RNA提取的小伙伴反饋說，看不懂RNA的質檢結果，不知如何對RNA質量進行評價，今天就帶大家一起看懂質檢圖。一般來說，RNA質檢圖有兩種，先是經瓊脂糖凝膠電泳初步判斷樣本的完整性，再是Aglient 2100 Bioanalyzer結果圖更為精確的判斷。
在看圖之前，我們首先要了解Total RNA中絕大多數是核糖體RNA（rRNA），占總RNA的80%以上，mRNA在總RNA樣品中僅占1-3%，所以我們質檢圖中直觀反映的是rRNA的檢測結果，依據rRNA的質量和數量可以反映潛在的mRNA質量和數量。達成了這個共識，我們就可以上圖說話了。
一、瓊脂糖凝膠電泳膠圖主要需查看以下幾方面：
1.看目的條帶是否明亮清晰
2.看泳道內是否有降解彌散區
3.看膠孔處有無蛋白污染
4.看有無DNA污染
5.看有無外源物種核酸污染
二、在看Aglient 2100 Bioanalyzer電泳圖前，我們需要了解一下沉降系數（S），即：反映生物大分子在離心場中向下沉降速度的一個指標，值越高，說明分子越大。
s=v/(ω2?r)，通常1S=10-13秒
不同生物之間rRNA的沉降系數存在較大區別，主要體現在以下三種組合：18s和28s rRNA（動物）；18s和25s rRNA（植物、低葉綠體含量的組織部位）；16s和23s rRNA（細菌）。同時，2100儀器檢測RNA時，有三種程序對應這三種rRNA的組合。然而2100儀器在檢測RNA時，只會根據所選擇的程序標注出相應rRNA組合，不會根據片段大小進行調整。所以在進行安捷倫2100檢測時，需要選擇正確的程序進行電泳，不然細菌也可能會被標注成18s和28s。
1、典型真核生物電泳圖
峰①為marker，25nt。
峰②為5s rRNA和5.8s rRNA，大小分別為120nt和160nt。
峰③為18s rRNA，1900nt。
峰④為28s rRNA，4700nt。
峰⑤可能是前體RNA，濃度較低，距離28s rRNA較近。
這是典型真核生物2100電泳圖中常見的5個峰，但不是所有真核生物都是這幾個峰，在最后的案例展示中會簡短的再介紹一些特殊質檢圖。
2、典型植物葉片電泳圖中“c峰，d峰，e峰”則是葉綠體rRNA造成的。
3、典型原核生物電泳圖
了解這些典型峰圖后，我們再簡單介紹下RNA完整度判定的金標準之一---RIN值。RIN值即為RNA完整值（RNA integrity number），這一指標從整體電泳圖出發，以消除RNA質量控制中的個人解釋。RIN數值范圍為1-10，將生物總RNA質量分類，其中1代表降解最嚴重的情況，10代表最完整。通過這種方式，有助于解釋電泳圖，令樣品之間的比較成為可能，并確保實驗的重復性。我們以真核哺乳動物為例，安捷倫2100質檢的樣本RIN值=2~10結果展示如下。從中可以看出RIN值越大，基線越平整、主峰越銳利。
三：特殊案例展示
1、昆蟲、軟體動物
雖然也是真核生物，但一般基線平整即可，由于28s rRNA存在“隱裂”現象，產生了2個小片段：28sα和28sβ，二者與18s重疊在一起形成了單峰趨勢。造成沒有28s或28s峰低的現象。
2、細菌
由于微生物種類繁多，若做過物、化處理，23s/16s值會差異較大。
3、動物細胞系
樣品出現下圖，18s rRNA和28s rRNA下分別有雜峰，這種多條帶現象，可能是微生物污染，也可能是線粒體RNA造成的，在一些褐色脂肪等富含線粒體的組織中也會出現這一現象。
4、宏轉錄組
存在多條帶現象。由于是宏樣品，物種組成不單一，樣品是否合格需根據不同樣品特性綜合判斷。
綜上所述，在進行RNA質量評判時，RIN值不能作為RNA完整性評判的唯一標準，還需結合基線是否平整，峰型是否銳利，有無拖帶，以及物種和模擬電泳圖進行綜合評判。
RNA質量直接影響文庫和測序質量，若完整度較差，則會存在文庫產量低、建庫失敗；測序數據隨機性差，可能會有偏好性；有效數據留存率低、mapping率低、基因覆蓋不均勻、rRNA殘留率高等風險，而對于Small RNA測序，則存在無目的條帶、目的條帶弱或雜帶多；有效數據留存率低，reads分布異常等風險。本著對客戶項目負責的原則，派森諾有著嚴謹的RNA提取和結果判定規范，助力各位老師項目高質量完成~
