2020-08-27
實時熒光定量PCR（Quantitative real-time PCR）是一種通過在PCR反應體系中引入一種熒光物質，對PCR擴增反應中每一個循環產物的熒光信號進行實時檢測，以此對初始模板進行定量分析的實驗。相對定量指的是在待測樣本中目的序列相對于另一對照樣本的量的變化，比較對兩個或多個不同處理的樣本中的基因表達水平的高低變化，得到的結果是比率。
我們為什么要做相對定量呢？
其中非常重要的一點就是對轉錄組測序的驗證。轉錄組測序是以數學模擬計算表達量，篩選的的基因比較多，一定程度上會有誤差，而熒光定量是對特異基因表達量的檢測，特異性相對更高。一個所謂數學方法，一個所謂實驗方法，干濕結合，才能確保分析結果的可靠性。
另外，相對定量的研究范圍很廣泛，樣品類型可以是動物，植物，細胞，菌體，土壤甚至是病毒RNA。其中研究的RNA可以是編碼RNA，也可以是非編碼的RNA，如：長鏈非編碼RNA（lncRNA），miRNA，circRNA等，為基因研究提供更多類型。
一．表達水平驗證：相對定量
1、實驗原理：
提取樣品中的總RNA,以其中的RNA作為模板，采用Oligo(dT)或隨機引物利用逆轉錄酶反轉錄成cDNA。再以cDNA為模板進行PCR擴增,而獲得目的基因或檢測基因表達。
2、注意事項：
（1）提取保證RNA的完整性
（2）引物設計：根據研究的目的序列，設計引物；建議在正式上機之前進行引物調試，根據CT值范圍和熔解曲線判斷引物是否有引物二聚體或非特異性擴增，引物是否可用。
（3）內參的選擇：選取一定的內參基因，以除去不同標本在RNA產量、質量以及反轉錄效率上可能存在的差別，進行校正和標準化。不同的內參在不同的組織中表達是有差異的；可以通過查找文獻或是選擇常用的多個內參進行實驗驗證。
3、標記物：
熒光定量所使用的標記物可分為熒光染料和熒光探針，其中比較常用的為SYBR Green I 染料和TaqMan探針。
SYBR Green I 是一種結合于所有雙鏈DNA小溝的具有綠色激發波長的染料。游離的染料分子不發光，在新合成鏈延伸過程中SYBR Green I與DNA雙鏈結合，發出熒光信號，一個反應發出的全部熒光信號與雙鏈DNA量成比例，隨擴增產物的增加而增加。
TaqMan探針是單鏈DNA，兩段分別標記一個熒光報告基團和一個熒光淬滅基團，探針完整時，報告基團發射的熒光被淬滅基團吸收；PCR擴增時Taq酶發揮5’-3’外切酶活性，使兩種基團分離，從而熒光檢測系統可以接受到熒光信號，每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，熒光信號的累積和PCR產物形成是同步的。
4、驗證成功案例：
期刊：INTERNATIONAL JOURNAL OF ONCOLOGY
影響因子：3.571
研究背景及意義
多形膠質母細胞瘤（GBM）是最常見的原發性惡性腦腫瘤，盡管近年來出現了多種治療方法，例如手術，放療和化學療法，但膠質母細胞瘤患者的總體生存率并未發生明顯變化。膠質瘤干細胞（GSC），具有自我更新的能力和多能性，并且可以誘導腫瘤發生，對神經膠質瘤研究日益重要。因此闡明控制GSC的分子機制可能為開發針對GBM的靶向治療提供新的信息。而之前的一些研究已經表明，溴結構域和末端外域蛋白，尤其是含溴結構域的蛋白4（Brd4），可能是多種癌癥的治療靶標，但是目前尚不清楚Brd4在多形膠質母細胞瘤（GBM）中的作用和機制。本研究旨在探討Brd4和溴結構域抑制劑JQ1對神經膠質瘤干細胞（GSC）的抗腫瘤作用的潛在機制。
研究方法
RT-qPCR，蛋白質印跡(western blotting)，RNA-Seq測序和分析，免疫熒光和免疫組化實驗等。
驗證結果展示
RNG測序實驗中，經JQ1處理后的CSC2078基因上調和下調的基因表達模式簇熱圖見圖A。對照組與JQ1處理后CSC2078不同的基因數見圖B。對照，JQ1處理組和siBrd4組中PI3K，AKT和p-AKT（Ser473）的蛋白質印跡分析表達結果見圖C和F。圖G和H則展示了p-AKT（Thr308）在JQ1處理的CSC2078細胞中的Western印跡分析表達結果。最下面的KEGG富集分析氣泡圖展示了，JQ1處理后，CSC2078的20個顯著富集的KEGG途徑。這些結果均表明PI3K / AKT信號通路在多形膠質母細胞瘤中起重要作用。
KEGG通路富集分析顯示細胞周期顯著富集。為了進一步研究Brd4在GSCs中調控細胞周期進展的機制，作者采用RT-qPCR檢測了JQ1處理的CSC2078和TS543細胞中與細胞周期相關的基因c-Myc、cyclin D1、p21和p27。發現c-Myc和CyclinD1的mRNA表達水平明顯受到抑制，而P21和P27的mRNA表達水平明顯上調。
由于AKT可在多種癌癥中激活細胞凋亡，作者研究了Brd4對GSCs凋亡基因的影響。作者利用RT-qPCR驗證了JQ1和siBrd4對CSC2078和/或TS543細胞中Bim、BAX、Bak、Bcl-2、Bcl-xl等PI3K/AKT信號通路中重要凋亡基因的影響。發現抑制血管內皮生長因子/PI3K/AKT信號通路可導致膠質瘤干細胞的細胞周期阻滯；抑制VEGF/PI3K/AKT信號通路可誘導GSCs凋亡。
研究結論
本研究旨在探討Brd4和溴結構域抑制劑JQ1對神經膠質瘤干細胞（GSC）的抗腫瘤作用的潛在機制。在體外，JQ1和靶向Brd4的小干擾RNA（siBrd4）抑制GSC的增殖和自我更新。在體內，JQ1顯著抑制異種移植GSCs腫瘤的生長。RNA-seq分析表明，PI3K-AKT途徑在GBM中起重要作用。通過JQ1處理GSC，血管內皮生長因子（VEGF）和VEGF受體2的磷酸化被下調，從而降低PI3K和AKT活性。此外，用siBrd4或JQ1處理可通過激活參與凋亡的AKT下游靶基因來誘導凋亡。總之，這些結果表明Brd4具有作為治療靶標的巨大潛力，而JQ1對GBM具有顯著的抗腫瘤作用，這可能是通過VEGF / PI3K / AKT信號傳導途徑介導的。
二．新型冠狀病毒檢測（探針法應用）
新型冠狀病毒檢測提取病毒RNA，針對其基因組中開放讀碼框1ab (open reading frame 1ab, ORF1ab) 和核殼蛋白(nucleocapsid protein, N) 序列設計熒光探針引物。通過Ct值來判斷是否為陽性。
結果判定
陰性：無Ct值或Ct≥40。
陽性：Ct值<37，可報告為陽性。
灰度區：Ct值在37-40之間，建議重復實驗，若重做結果Ct值<40，擴增曲線有明顯起峰，該樣本判斷為陽性,否則為陰性。
在實驗室要確認一個病例為陽性，滿足以下條件： 同一份標本中新型冠狀病毒2個靶標（ORF1ab、N）特異性實時熒光RT-PCR檢測結果均為陽性。
