2020-08-25
導讀
在農業科學中，為了提升作物農藝性狀，經常會遇到將與性狀相關的基因或位點在基因組上進行定位的需求，此時BSA作為一種簡便又高效的分析方法便有了大顯身手的機會。可是BSA究竟是怎樣的一種研究方法呢，適用于什么群體呢？跟著小編了解一下吧！
什么是BSA?
BSA（Bulked segregation analysis）即混合分組分析，也稱分離群體分組分析，是指利用目標性狀存在極端表型差異的兩個親本構建分離群體，在子代分離群體中，選取兩組表型差異極端的個體分別構建混合池 ，結合高通量測序技術對混合樣本測序，比較兩組群體在多態位點（SNP）的等位基因頻率（AF）是否具有顯著差異，定位與目標性狀相關聯的位點并對其進行注釋，研究控制目標性狀的基因及其分子機制。
相較于傳統的遺傳學研究方法（基因定位常用分析方法，小編已經安排上啦?。?，BSA最大的特點是不需要對群體中的所有個體進行基因分型，而是對挑選的個體按照性狀進行混合分析，所以可以極大地降低研究的工作量和成本。
什么樣本適合BSA分析?
既然BSA已經兼具了簡便，準確、高性價比等優點，自然也有自己的小性子了，BSA分析對使用的群體有一定要求。
1、人工構建的遺傳群體（最常用來的是F2、BC、RIL）。通常來說，使用自然群體和遺傳群體都可以進行BSA分析，但是考慮到遺傳背景較復雜，可能導致定位結果不理想，所以不推薦使用自然群體進行BSA研究。
2、親本目標性狀差異明顯，其他性狀差異隨機分布，所構建分離群體兩個混池之間目標性狀有顯著差異，非目標性狀無明顯差異。
3、有合適的參考基因組信息。參考基因組組裝的越好，信息越全，對于后續基因定位和候選區間的注釋都會更加精確，可以鎖定候選區間并估計候選區域的大小。沒有組裝到染色體級別的參考基因組，分析思路是一樣的，但只能得到某個或某些scaffolds中的snp與性狀相關，無法估計候選區間大小，甚至再組裝結果差的情況下，無法判斷基因的物理位置。
BSA有哪些分析方法？
1、SNP index及△SNP index
SNP-index作為主流的BSA定位的算法，最早在2013年被提出（Takagi）。它的基本原理是，構建子代分離群體，經過挑選極端性狀構建混池后對SNP進行檢測，對各混池進行等位基因頻率分析，并與其中一個親本進行比較。與此親本不同的基因型所占的比例，即為該位點的SNP-index。從下圖可以看到，兩個位點的SNP-index分別為0.4和1。值得注意的是，這里的reference指的并不是我們進行重測序變異檢測的參考基因組，而是我們構建群體所使用的親本。這也是為什么進行SNP-index計算必須依賴于親本測序數據的緣故。
每個混池都得到一組SNP-index數據之后，兩個混池相減(上圖右)，即得到了△SNP-index的結果，代表的是兩個混池之間SNP基因型頻率的差異。理論上說，不與性狀相關的位點，△SNP-index的值應當在0左右，代表混池之間不存在差異；而QTL及其相連鎖位置的SNP，△SNP-index值應當呈現較高的數值?！鱏NP index這種分析方法會存在因統計偏差造成的假陽性位點，這時我們可以通過計算滑窗內所有SNP的△SNP-index，來消除其影響，得到真正QTL所在的基因組區域。
2、歐幾里得距離(ED)
隨著BSA技術的發展，SNP-index顯示出了一定的局限性，比如親本數據缺失，林木類較難構建分析群體，ED值的分析方法應運而生。在BSA和BSR中，歐幾里得距離可以計算同一個位點上，兩個混池之間的等位基因頻率。兩個極端性狀子代混池只在控制性狀的QTL及其連鎖位點出現差異，所以通過各個位點歐幾里得距離的計算，我們可以判斷哪些位點更可能是控制對應性狀的QTL。計算公式如下：
實際應用中，我們在BSA的兩組混池之間可能會得到數十萬甚至上百萬個SNP，有的SNP可能實際與性狀無關，但因為抽樣偏差，導致計算得到的ED值很高，為了排除統計異常值，我們通常會采用滑窗對在一個窗口內所有位點的ED值進行擬合，消除抽樣偏差產生的假陽性結果。而在BSA定位區間計算過程中，會對ED值采取乘方處理，放大ED值的差異，使定位區間更加明顯。
3、Gradedpool-seq（Ridit檢驗）
Gradedpool-seq的概念在2019年由韓斌和黃學輝課題組提出并發表于Nature Communication（Wang et al., 2019）。這種方法與常規BSA類似的是，它也是基于性狀分離群體中按照性狀選擇子代個體構成混池（通常加上親本）進行測序，并進行QTL定位的方式。Ridit是relative to an identified distribution unit一詞的縮寫，它是一種非參數檢驗分析方法，用于按等級分組資料的比較。而對于多個混池測序數據，Ridit檢驗會對每個位點的等位基因頻率進行計算，判斷其是否顯著偏離標準分布，得到一個p值。換言之，這個位點的p值越小，即代表這個位點與性狀相關聯的可能性越高（與GWAS關聯方法類似）。
由于在BSA項目中Ridit檢驗的對象只有2-4個混池，基因型數據較少，所以當Ridit檢驗的結果用曼哈頓圖的形式展現出來，其噪音非常強烈，很難從中直觀地判斷我們的候選區間的位置。研究者們選取一定大小的窗口，并且將窗口內的SNP位點進行統計，計算p值低于閾值的位點所占的比例。一般經過這種滑窗降噪處理，其關聯區間也就顯現出來了。
好啦，嘮叨了這么多，不知道大家是不是有所收獲呢？對于這種即簡便又實用的小可愛，是不是難以拒絕呢？區間定位到了，后續如何進行精細定位與驗證呢？請聽小編下回分解啦!
參考文獻：
1.Hill JT,et al. MMAPPR: mutation mapping analysis pipeline for pooled RNA-seq. Genome Res. 2013, 23(4):687-97
2.Takagi H, Abe A,Yoshida K, et al. QTL‐seq: rapid mapping of quantitative trait loci in riceby wholegenome resequencing of DNA from two bulked populations[J]. Plant Journal,2013,74(1):174-83.
3.Wang, C., Tang, S., Zhan, Q. et al. Dissecting a heterotic gene through GradedPool-Seq mapping informs a rice-improvement strategy. Nat Commun 10, 2982 (2019).
