2020-08-14
上次通過簡單的入門知識，速看！高分文章的新陣地——空間轉錄組，技術入門來啦！(點擊查看)，我們對空間轉錄組的基礎信息做了一個了解，那么，經過手術或者是基礎實驗，獲得了一系列腫瘤及其臨近組織的組織樣本和病理切片，想要發表高分文章，針對手上的資源，可提出怎樣的生物學問題？又要如何設計實驗解決提出的問題呢？
下面咱們就以這篇今年發表于nature biotechnology的關于胰腺癌的文章為例，來聊聊這個文章思路的關鍵問題。
文章中對思路進行了概述：
整理下來即為：
首先，作者對兩例胰腺癌患者的樣本進行了單細胞測序，發現了一個非常有意思的結果：PDAC-A病例中有兩類不同類別的腫瘤細胞；而PDAC-B病例中只有一種類別的腫瘤細胞（圖1）。于是，一個生物學問題產生了：這兩個病例中的總共三類腫瘤細胞，彼此之間有怎樣的差異？在基因表達水平，信號傳導水平，空間分布水平，以及與其它類別細胞間通訊水平，是否存在差異，這些差異，以怎樣的形式進行闡釋？
圖1：單細胞測序結果展示
針對上面的問題，主要目的其實就是一方面想要得到客觀全面的信息，而一方面想要聚焦于病理切片去闡述一些信息，對于切片方面的進一步研究，空間轉錄組測序研究無疑是較優選擇。
其次，作者對上述兩例病例也收集了病理切片樣本，針對病理切片進行空間轉錄組測序分析，最后通過MIA (Multimodal intersection analysis) 分析將單細胞分析結果和空間轉錄組結果進行聯合分析，獲得了一些關鍵性結果：
01、關注空間轉錄組數據的特定亞群內，分析在這一區域的各單細胞轉錄組數據亞群，旨在揭示腫瘤區域內的含有哪些細胞類型。結果顯示，在PDAC-A中，腫瘤區域除了富含腫瘤細胞，也富含成纖維細胞，而在PDAC-B中，則并不富含成纖維細胞（圖2，3）。
圖2：空間轉錄組（ST）結果展示（a，b:帶注釋的PDAC-A和PDAC-B腫瘤冷凍切片。c，d：PDAC-A和PDAC-B ST數據集中的三個基因的標準化表達水平。e，f：PDAC-A和PDAC-B ST點陣的聚類）
圖3：不同樣本空間轉錄組的空間亞群內不同細胞類群的比較
02、關注單細胞數據的特定亞群，分析這些亞群分布在哪些空間轉錄組數據的亞群中，旨在揭示同一類別的細胞，分別聚集分布在腫瘤的哪個區域。根據單細胞轉錄組的細胞亞群分類結果，聯合空間轉錄組數據顯示，以胰管細胞為例，在PDAC-A中，在腫瘤區域內富含APOL1高表達，即指示缺氧環境的胰管細胞以及末梢導管。在PDAC-B中，則不含任何胰管細胞 （圖4）。
圖4：胰管細胞亞群內在不同空間位置的分布比較
03、由于在前面scRNA-seq數據中發現PDAC-A的兩個癌細胞亞群在遺傳上的基因水平和轉錄水平上都是不同的，因此為了更好的研究這兩個亞群，又額外取了2張PDAC-A腫瘤不同區域的組織切片進行了ST實驗和分析，最后綜合三個PDAC-A組織切片ST數據和scRNA-seq數據，MIA分析發現成纖維細胞在癌細胞亞群1中富集程度高，在亞群2中富集程度則比較低或者無富集。這種模式表明，癌細胞亞群1可能在組織中引起特定的基質反應，或者癌細胞亞群2可能與組織中的成纖維細胞互斥（圖5）。
圖5：癌癥亞區域顯示出不同的細胞類型和亞群富集（a–c，確定3個PDAC-A的ST癌癥區域中的子區域。d，在PDAC-A中鑒定的癌癥的子區域的MIA圖以及在圖1和2中鑒定的細胞類型和細胞亞群。）
04、關于癌細胞的scRNA-seq數據的最新研究表明，多種癌癥類型中都有其獨特的細胞狀態，因此作者考慮使用MIA方法將癌細胞狀態映射到不同的空間組織區域并表征它們與其他細胞類型的相互作用。
為了這一目的，文中加測了一個PDAC的 scRNA-seq，綜合分析scRNA-seq數據集后定義了PDAC癌細胞之間的三個基因表達模塊，其中應激響應模塊對本研究尤為重要。之后通過來自6個患者的樣本隊列的10個ST實驗數據和MIA分析，發現了應激模塊高表達基因與炎性成纖維細胞之間的強富集關系。
最后通過結合數據庫中的一些之前的普通轉錄組數據發現，只有應激反應基因模塊與炎性成纖維細胞特征顯著相關。作者追加了免疫熒光實驗與免疫熒光切片相鄰的組織切片的H＆E染色實驗，進一步證明炎性成纖維細胞與表達應激反應基因模塊的癌細胞之間存在信號傳導關系。并通過對其他腫瘤的數據的MIA分析，驗證了MIA方法在研究細胞群與空間受限結構之間的關系上的實用性(圖6)。
圖6：繪制癌細胞狀態與其他細胞亞群之間的關系圖
小 結
作者整體上就關注了兩個變量：空間區域和細胞類型。主題思路就是固定一個變量，分析另一變量在該變量中的情況。
那么，除了上述兩個變量，是否存在其它變量，可以進行更全面的分析，以解釋更精確的生物學問題呢？答案是肯定的。變量3可以是信號通路，變量4可以是存在受體和配體互作關系的細胞間通訊等等。接下來的文獻解讀專題，我們將通過另一篇science的文章，解讀作者如何分析空間區域、細胞類型和信號通路之間的關系，通過這樣的分析，以幫助解決這樣的生物學問題：針對某一感興趣的基因，是否可以通過其空間表達模式篩選到其共表達的基因，研究參與同一生物學過程的未知基因的生物學功能，進一步揭示感興趣生物學過程的分子機制。感興趣的伙伴，請密切關注我們的后續更新。
升級版的10x Genomics Visium空間轉錄組技術相對于文章使用的早版的ST技術，單細胞分辨率上表現更加卓越，助力高分文章更是不在話下！想要研究空間表達情況，要獲取無偏數據、甄選關鍵數據的你，趕緊行動起來吧!
文獻索引：
Moncada R, Barkley D, Wagner F, et al. Integrating microarray-based spatial transcriptomics and single-cell RNA-seq reveals tissue architecture in pancreatic ductal adenocarcinomas[J]. Nat Biotechnol. 2020;38(3):333‐342. doi:10.1038/s41587-019-0392-8
原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41587-019-0392-8
