2020-08-11
今年7月哥倫比亞大學、澳大利亞海洋科學研究所以及德克薩斯大學奧斯汀分校的研究者們在Science上聯(lián)合發(fā)表了文章，他們通過對大堡礁中心約300km范圍內(nèi)一種造礁珊瑚進行群體遺傳學研究，構建了一個可以預測珊瑚白化的統(tǒng)計模型，為全球珊瑚物種的保護提供了有利的工具。
項目背景
人為的全球變暖正在改變?nèi)虻纳鷳B(tài)系統(tǒng)，迫使物種迅速響應不斷變化的環(huán)境。海水溫度升高對海洋生態(tài)系統(tǒng)的影響尤其具有破壞性，使得全世界的珊瑚礁正以驚人的速度減少。珊瑚礁覆蓋不到1％的海底，但卻擁有者超過海洋1/4的生物多樣性，對人類的重要性不言而喻。
升高的海水溫度（甚至僅略高于長期最大值）也會導致珊瑚的白化現(xiàn)象，長期的白化最終可能導致珊瑚群落的死亡。面對迅速升高的海水溫度，迫切需要采取新的保護策略，以防止珊瑚群落的大規(guī)模的損失。而這些工作的順利開展，離不開對珊瑚白化遺傳基礎的清晰了解。
不同珊瑚物種和同種珊瑚內(nèi)的不同個體對白化和對熱脅迫的響應各有不同，存在表象差異；在印度洋-太平洋地區(qū)普遍分布的鹿角大珊瑚（Acropora millepora）中，研究表明其耐熱性是部分可遺傳的，因此，理論上個體間的白化差異應該可以從基因組數(shù)據(jù)中加以預測。
白化現(xiàn)象：溫度或鹽度變化帶來的生態(tài)壓力破壞了造礁珊瑚與其細胞內(nèi)光合鞭毛藻（共生雙鞭毛科）之間的共生關系，這種現(xiàn)象稱為白化現(xiàn)象。
實驗材料與方法
1 、基因組組裝與注釋
組裝物種：A. millepora
測序策略：PacBio、10X Chromium barcoded單細胞測序法（illumina PE）
組裝策略：pacbio數(shù)據(jù)組裝contigs；10×單細胞數(shù)據(jù)連接scafflod和矯正，50×幼蟲非共生基因組測序數(shù)據(jù)剔除共生藻類數(shù)據(jù)；簡化（RAD）遺傳圖譜數(shù)據(jù)重排contigs；轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)預測基因及組裝結果注釋。
2、 樣本收集及表型判定
樣本選取: 從12個分布在大堡礁中心約300公里范圍內(nèi)的珊瑚礁中收集了253個鹿角珊瑚個體。
樣本采樣時間：2017.3.14~2017.4.1（白化高峰期）。
表型判定：白化等級判定，
1、視覺白化得分，Coral Color Reference Card ；
2、光合色素濃度（吸光度665、649、632nm）；
3、共生體細胞密度，DC Protein Assay。
3、群體遺傳學及微進化分析
測序策略：從12個群體中各選出4個個體進行>20x的高覆蓋度重測序；
分析內(nèi)容：連鎖不平衡（LD）衰減分析，核苷酸多樣性分析，歷史有效種群大小（Ne）、有效遷移率、基因組單倍型 。
4、白化現(xiàn)象全基因組關聯(lián)分析
測序策略：作者只對采集的珊瑚中48個個體進行了高覆蓋度基因組測序，剩下的個體則是采用低覆蓋度測序進行的。
分析方法：根據(jù)44個個體的重測序數(shù)據(jù)，用read-back phasing法構建了參考單倍型集合，并用此對低通量測序樣本進行了基因型填補，排除了可能是物種鑒定錯誤、罕見的變異譜系、親緣關系太近、以及表型數(shù)據(jù)缺失的異常值后，最終213個表型樣本進行全基因組關聯(lián)分析。
5、PGS(白化預測模型)的構建與驗證
分析方法：基于LD的聚類和GWAS中估計的SNP效應量構建了多基因評分模型（PGS，或稱育種值）。由于缺乏除了所研究樣本之外的其他數(shù)據(jù)，用Jackknife交叉驗證法評估了PGS的預測準確性。
結 果
1、參考基因組組裝(物種：Acropora millepora（鹿角大珊瑚）)
圖1. 鹿角大珊瑚基因組組裝及結果
最終獲得了一個大小為475M的基因組，其scaffold N50值達到了19.8Mb。隨后，用已發(fā)表的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，從得到的基因組中預測到了28,188個基因，其中超過96%的基因在真核生物中都存在單拷貝同源。
2、群體遺傳學樣品采集
圖2. 采樣地分布圖（B）及環(huán)境因子主成分分析（C）
為了研究與白化響應相關的遺傳變異，2017年3月的一次白化高峰期間，研究者們從12個分布在大堡礁中心約300公里范圍內(nèi)的珊瑚礁中收集了253個鹿角珊瑚個體樣本（圖2B），并采集了這些珊瑚棲息地的生態(tài)環(huán)境數(shù)據(jù)。
將40個不同的環(huán)境空間參數(shù)進行整合分析，發(fā)現(xiàn)采集的珊瑚樣本的分布深度介于1.2-7.2m之間，涵蓋了鹿角大珊瑚在礁坪和礁上斜坡上的通常分布深度范圍。采樣地的生態(tài)條件則隨經(jīng)度和緯度不同而變化，12個采樣地的月平均海水表層溫度差異超過了0.5℃（圖2C）。
3、白化表型評估
圖3 白化程度表型評估
對這些珊瑚個體的視覺白化得分、光合色素濃度、共生體細胞密度這三個指標進行測定，用以衡量其白化程度。結果顯示，這253個珊瑚個體的白化表型間存在較大的變異。
4、連鎖不平衡衰減及歷史種群大小分析
從12個群體中各選出4個個體進行>20x的高覆蓋度重測序，獲得了將近680萬個高質(zhì)量SNPs位點。經(jīng)主成分分析，剔除掉了4個可能存在鑒定錯誤或罕見譜系分化的離群個體，保留了44個不存在親緣關系的個體進行后續(xù)分析。
圖4. 鹿角大珊瑚連鎖不平衡（A）、核苷酸多態(tài)性（B）及歷史種群大小（C）分析
從獲得的680萬個SNP位點中隨機選出1%進行連鎖不平衡（LD）衰減分析，結果顯示當兩個位點間的距離達到約15kb時，其平均r2值就降到了0.05以下（圖3A）。對非重疊基因間區(qū)1 kb窗口內(nèi)的核苷酸多樣性（π，即每個堿基對的平均兩兩差異）進行計算，得到的平均π為0.363%（圖3B）。如以每代每個堿基對的突變率為4×10e?9為標準計算，這個多樣性值對應的長期有效種群大小（Ne）約為2.26×10e5。
對每個測序個體進行成對序列馬可夫共祖（PSMC）分析，推斷出了這些珊瑚群體在過去約一百萬代內(nèi)的Ne變化情況。結果顯示，與在其他珊瑚中發(fā)現(xiàn)的類似，采集的多孔軸孔珊瑚的Ne在過去的一百萬代內(nèi)均呈穩(wěn)定下降趨勢，并且這些珊瑚群體的種群演變軌跡高度相似（圖3C），表明這些多孔軸孔珊瑚的祖先群體很可能具有很大的種群大小和群體結構，而相似的種群動態(tài)歷史則反映這12個采樣地的珊瑚礁間可能存在高度的連通性。
5、群體結構分析
圖5 鹿角大珊瑚群體結構分析
研究者們對這12個群體的遺傳距離（FST）進行了計算，結果發(fā)現(xiàn)，盡管采樣地間的環(huán)境差別很大，但這些珊瑚樣本間的FST幾乎均接近0，并且其FST也與地理距離無關（圖5A）。PCA分析結果也顯示這12個群體間不存在明顯的群體結構（圖5B）。對這些珊瑚群體的相對有效遷移率的評估結果也顯示，取樣的珊瑚間不存在明顯的基因流障礙（圖5C），證實了這些群體間的遺傳分化程度確實很低！
分析其原因，這種跨越如此大地理范圍的基因流模式，很可能是鹿角大珊瑚廣泛產(chǎn)卵的繁殖方式造成的。
6、熱休克共伴侶蛋白分析
盡管這12個群體幾乎不存在遺傳分化，但其分布范圍內(nèi)的環(huán)境條件尤其是熱狀況的差異卻很大。自然狀態(tài)下，成年珊瑚個體只與附近的個體繁殖，但珊瑚幼蟲卻可以擴散到更遠的范圍，因而每一代幼蟲在不同的珊瑚礁定居下來后，都可能受到很強的選擇。模型表明，在持續(xù)遷移中因強烈空間異質(zhì)性受到的選擇，會使生物基因組內(nèi)一些局部有益的等位基因被長期保留下來。
為了尋找鹿角大珊瑚適應性相關的變異，作者們對基因組中多樣性高的區(qū)域進行掃描，因為這些區(qū)域可能是長期平衡選擇的結果。經(jīng)掃描，發(fā)現(xiàn)整個基因組中多樣性最高的區(qū)域位于7號染色體上，該區(qū)域包含一個sacsin的直系同源基因（圖6A）。單倍型頻率分析顯示，該區(qū)域的h12統(tǒng)計值也很高，表明這個區(qū)域存在受選擇的單倍型（圖6B）。將基因組每10-kb窗口的序列進行PCA分析，發(fā)現(xiàn)與基因組其他部分相比，該區(qū)域在PCA結果中也顯得格外突出，證實這種親緣關系模式并不尋常。所有這些結果都指向一個異乎尋常的系譜關系——即在進化上，包含sacsin基因的兩個單倍型的分化時間甚至比柔枝軸孔珊瑚（A. tenuis）和指形軸孔珊瑚（A. digitifera）的分化還要早（圖6C）。
圖6 全基因組多態(tài)性掃描及sacsin基因進化樹分析
Sacsin是熱休克蛋白Hsp70的共伴侶，包含多個與Hsp90同源的區(qū)域。軸孔珊瑚屬（Acropora）和杯型珊瑚屬（Pocillipora）中多種珊瑚的sacsin基因在實驗室內(nèi)高溫下均顯著上調(diào)表達，表明該基因的變異可能與自然種群的熱響應有關。sacsin基因顯示的高度多樣性表明該基因是平衡選擇的目標，位于該基因處的變異已經(jīng)維持了相當長的時間（數(shù)百萬代），因此在野外和實驗室中都具有重要的功能。進一步對sacsin基因單倍型頻率與環(huán)境因子的相關性分析顯示，該單倍型的頻率可能與共生藻的類型有關（P = 0.059），但與遺傳或環(huán)境主成分之間均無相關性（P > 0.15），不過整體上仍不清楚具體是哪種因素造成sacsin基因受到強烈的平衡選擇。
7、白化表型全基因組關聯(lián)分析
用這213個個體的基因型數(shù)據(jù)再次對12個群體進行群體遺傳學分析，結果仍顯示這12個群體間幾乎沒有群體分層、存在高度基因流，并且在scasin基因處的多態(tài)性最高。
圖7 共生藻組成和白化之間相關性分析
此外，測序也獲得了共生在珊瑚體內(nèi)共生藻的基因組數(shù)據(jù)。對每個珊瑚樣本中的共生體種類進行分析，發(fā)現(xiàn)珊瑚樣本中共生體reads的豐度隨視覺白化得分這一表型的不同而存在顯著差異（圖7A），并且也與葉綠素總含量和共生體細胞密度相關。通過計算比對到珊瑚基因組上的reads的相對比例，進一步確定了共生體的組成類型，發(fā)現(xiàn)以Durusdinium為優(yōu)勢共生體的珊瑚擁有更高的白化視覺得分（圖7B），這與先前研究發(fā)現(xiàn)的，野外環(huán)境中以Durusdinium為優(yōu)勢共生體的珊瑚通常具有更高的耐熱性（但其生長速度較慢）相一致。整體上，這表明使用低覆蓋度測序方法可以在對白化進行定量的同時，確定共生體的相對組成類型。
圖8 視覺評分表型曼哈頓圖
接下來，作者用線性混合模型（LMM）對3個白化表型指標與獲得的基因型數(shù)據(jù)進行GWAS分析，并將環(huán)境變異主成分的前4維、遺傳變異主成分的前兩維、批次效應、采樣深度、共生體reads中Durusdinium所占的比例作為協(xié)變量加入模型中。三個測定的白化表型間存在高度相關，但因葉綠素含量（n=190）和共生體細胞密度（n=172）的表型有缺失，作者們把重點放在了視覺得分（n=213）的GWAS結果上。結果在基因組上沒有檢測到與白化顯著相關的SNP位點，表明不存在與白化變異相關的主效基因座（圖8）。
8、自然珊瑚個體白化響應的預測模型構建
上述GWAS分析結果顯示，鹿角大珊瑚白化的表型變異是受多基因控制的，因此難以鑒定致因位點，這和桌形軸孔珊瑚耐熱性研究的結果一致。盡管如此，有了對基因組上每個SNP位點效應的評估結果，就可以幫助我們預測表型。因此，研究者們用基于LD的聚類和GWAS中估計的SNP效應量構建了多基因評分模型（PGS，或稱育種值）。由于缺乏除了所研究樣本之外的其他數(shù)據(jù)，他們用Jackknife交叉驗證法評估了PGS的預測準確性。
圖9 模型預測的準確性評估
為了增加模型的預測準確性，他們將批次效應和遺傳效應主成分作為協(xié)變量加入模型中。此外，考慮到環(huán)境和遺傳因素都有會影響白化的變異，因此將環(huán)境效應、優(yōu)勢共生體類型（以測得的Durusdinium的reads比例表示）這兩個因素也加進來。經(jīng)交叉驗證后發(fā)現(xiàn)，在上述線性模型中加入這些預測因子后，模型的預測精度明顯提高（圖9B）。尤其地，后兩者的加入使得模型的準確性得到了極大提升。總的來說，這個模型對珊瑚樣本視覺白化得分這一表型變異的解釋率達到了62%左右。不過，進一步講，這一模型的準確性還需使用另一個不同的樣本集進行驗證，僅僅靠交叉驗證還不夠。
在制定保護策略時，白化預測模型可以幫助區(qū)分不同棲息地中更有可能耐受的個體，為當前的空間保護策略和對珊瑚礁未來的預測提供信息。使用上述完整的預測模型和交叉驗證程序，預測得到的表型值最高的1/4個體的平均視覺得分明顯高于最低1/4的個體（圖9C）。該方法也可以幫助識別最耐受的個體，用于管理移種和選擇育種，以輔助基于進化的保護策略。在這點上，多孔軸孔珊瑚在如此大地理距離上缺乏種群結構的特點，使其成為一個理想的系統(tǒng)，可以從多個地方繁殖具有高預測特征值的珊瑚。此外，該模型的預測還可用來增加這些珊瑚在本地種群中的數(shù)量，而不需要通過輔助基因流來轉(zhuǎn)移它們，從而降低基因滲入風險和倫理問題。
主要結論
1、為2017年白化高峰期在澳大利亞大堡礁中部12個珊瑚礁那里收集的237個樣本進行了染色體尺度的基因組組裝，并獲得它們的全基因組序列 ；
2、用規(guī)模適中的參考單倍型panel（reference haplotype panel）可靠地推算低覆蓋率測序數(shù)據(jù)中的基因型，從而為未來大規(guī)模的全基因組測序工作提供了一種具有成本效益的方法；
3、群體結構分析表明在被采樣的珊瑚礁上檢測到的種群結構非常少，推測可能是由于鹿角大珊瑚的廣播式產(chǎn)卵繁殖模式造成的；
4、在這種基因組背景下，他們在熱休克輔助伴侶蛋白（heat-shock co-chaperone）sabsin中檢測到異常古老的變異，這與作用于該基因的長期平衡選擇是相一致的；
5、他們的基因組測序方法同時提供了對白化的定量測量，并確定了珊瑚宿主內(nèi)存在的共生物種的組成；
6、對白化現(xiàn)象進行了全基因組關聯(lián)分析，沒有找到明顯的關聯(lián)基因組，這表明白化反應的變異并不是由具有較大效應的共同位點造成的；
7、整合了根據(jù)全基因組關聯(lián)數(shù)據(jù)、相對共生物種組成的基因組數(shù)據(jù)、環(huán)境變量估計的遺傳效應的模型可預測個體白化表型。
本文研究高溫和白化的遺傳學對于預測珊瑚適應氣候變化和珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)的未來至關重要。這些知識也支持常規(guī)的管理方法和新的干預措施的開發(fā)。這項研究提供了對白化反應的遺傳結構的新見解，并作為在保護工作中使用基因組方法的原則證明。這些研究人員發(fā)現(xiàn)，一種基于環(huán)境因素、共生物種的基因組數(shù)據(jù)和珊瑚宿主全基因組關聯(lián)數(shù)據(jù)的模型，可以幫助區(qū)分最耐受白化的個體和最容易受白化影響的個體。因此，這些結果為從基因組角度預測鹿角大珊瑚和其他珊瑚物種的白化反應奠定了基礎。
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文章索引：
Zachary L. Fuller*, Veronique J. L. Mocellin, Luke A. Morris et al. Population genetics of the coral Acropora millepora: Toward genomic prediction of bleaching. Science 369, 268 (2020)
