2020-07-16
16S rRNA基因是細菌系統分類研究中最常用的分子標記，在進化上具有良好的時鐘性質，其序列包含相互間隔的10個保守區和9個可變區，保守區物種間變化不大，而可變區具有屬或種的特異性。利用高通量測序技術對16S rRNA基因可變區進行測序，能全面解析樣本中的物種組成和對應的豐度信息，因此被廣泛應用于微生物群落研究。
然而需要注意的是，當前基于高通量測序的微生物群落多樣性研究，都是基于相對定量的方法，即把數據歸一化到統一數據量，以每種菌reads數占總reads數的豐度比例來進行量化分析。這種定量方式存在的問題也是顯而易見的，由于16S擴增子文庫的構建有一個無法回避的過程，那就是PCR擴增。只要存在PCR擴增，就會有重復的產生，而擴增偏好性引發的重復的不均勻性，就是相對豐度不可靠的罪魁禍首。也許你會說，我們可以在生信分析端把重復都去掉，然而現實是這些重復的來源不同，代表的意義也不同，一刀切的去重同樣也歪曲了事實，圖一列舉了微生物群落多樣性研究的測序數據中重復的主要來源：
圖一：測序數據中重復的主要來源
①中重復代表的是同種菌的不同分子，是真實物種豐度的呈現，這種重復需要被保留，而②和③這些重復是由擴增產生的假重復，他的數量不能代表PCR擴增前物種的原始組成，尤其當部分序列存在PCR擴增偏好時，Reads數被人為提高，從而導致定量不準，這些重復是需要去除的。
總的來說，PCR擴增之前的重復需要保留，PCR擴增之后的重復需要去除。怎么實現呢？UMI(Unique Molecular Identifier)數字標簽技術這時候就派上用場了，只要在PCR擴增之前給每個分子加上一個特有的標簽，之后無論經過多少個循環的擴增，這個標簽都一直伴隨著同步進行復制，最后可以通過UMI的種類對真重復和假重復進行區分，從而達到去除擴增重復的目的。下圖分別展示了常規兩步法建庫和利用UMI數字標簽建庫的流程：
圖二：16S擴增子建庫流程 ,左，常規兩步法建庫流程,右，UMI數字標簽建庫的流程
從上圖不難看出，既往基于測序reads數進行微生物群落多樣性定量，定量值偏離真實值，在采用了UMI數字標簽之后，根據UMI標簽的種類進行定量，定量值更接近于真實值，校正了由PCR擴增偏好帶來的影響。
UMI數字標簽真就如此神奇嗎？適用于哪些微生態場景的研究呢？咱們下期再來分享。
