人類基因組圖譜及其初步分析結(jié)果的報(bào)道,以及多種模式生物、重要生物基因組全序列的完成,標(biāo)志著結(jié)構(gòu)基因組學(xué)的研究已取得重大進(jìn)展。隨之而來(lái)，生命科學(xué)研究進(jìn)入所謂的“后基因組時(shí)代”。一個(gè)以揭示基因組的功能及調(diào)控機(jī)制為目標(biāo)的功能基因組學(xué)的研究將是今后幾代科學(xué)家不懈奮斗的目標(biāo)。功能基因組學(xué)的研究是21世紀(jì)國(guó)際研究前沿之一，也是最熱門的研究領(lǐng)域之一。
功能基因組學(xué)是基于基因組序列信息，利用各種組學(xué)技術(shù)，在系統(tǒng)水平上將基因組序列與基因功能(包括基因網(wǎng)絡(luò))以及表型有機(jī)聯(lián)系起來(lái)，最終揭示自然界中生物系統(tǒng)不同水平的功能的科學(xué)。前人在實(shí)驗(yàn)手段及技術(shù)方面做了大量的研究就探索，用于確定一個(gè)基因有什么功能，為什么這個(gè)基因有這樣的功能，影響同一性狀的不同基因之間有沒(méi)有什么聯(lián)系……今天小編就帶大家一起來(lái)了解下其中一項(xiàng)常用的驗(yàn)證手段-酵母雙雜交技術(shù)。
兩個(gè)煙草品種的不育（CMS）系和保持系：
（1）yunyan85的保持系（YY85）及其不育系（sYY85)；
（2）zhongyan90的保持系（ZY90）及其的不育系（sZY90）。
煙草屬于茄科，目前，茄科的線粒體基因組數(shù)據(jù)大多為二代測(cè)序數(shù)據(jù)，缺少第三代測(cè)序數(shù)據(jù)，且植物線粒體基因組的結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，需要第三代測(cè)序技術(shù)，以獲得更加優(yōu)質(zhì)的基因序列。而正常線粒體基因組和不育線粒體基因組之間的比較分析將有助于研究不育機(jī)理，并篩選造成植物不育的相關(guān)基因。
因此本研究分為兩個(gè)部分，首先是使用PacBio和IlluminaHiseq技術(shù)對(duì)兩個(gè)煙草品種（YY85，sYY85，ZY90和sZY90）的不育系和保持系的花蕾的線粒體基因組進(jìn)行了測(cè)序，并通過(guò)基因組de novo測(cè)序的比較分析獲得一些與不育相關(guān)的候選基因，然后使用酵母雙雜交技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證了參與不育機(jī)制調(diào)控的相關(guān)蛋白之間相互作用強(qiáng)度的差異。
比較了YY85，sYY85，ZY90和sZY90的線粒體基因組特征。不育系的基因組顯著大于其相應(yīng)保持系的基因組，比后者擴(kuò)展了約30–60kb。雙鏈斷裂（DSB）修復(fù)可能發(fā)生在編碼DNA或非編碼DNA上，二者分別是準(zhǔn)確的和不準(zhǔn)確的。大多數(shù)DNA修復(fù)是通過(guò)DSB的產(chǎn)生來(lái)介導(dǎo)的，非編碼序列中不正確的修復(fù)性能往往會(huì)引入非同源序列。這使得非編碼DNA進(jìn)化很快，以至于植物線粒體基因組經(jīng)歷了重大的重排和擴(kuò)展。
在四個(gè)線粒體基因組中共發(fā)現(xiàn)30個(gè)保守的編碼基因。atp9，nad3，sdh3，cob，rpl5，rps14和mat-R，以及ccmC，rpl2和atp4的存在均顯示了保守編碼基因的差異。值得注意的是，在YY85和ZY90中都有另一個(gè)nad3（nad3-D2）拷貝。減少的nad3拷貝數(shù)可能會(huì)導(dǎo)致該基因在sYY85和sZY90中的表達(dá)下降，這可能會(huì)進(jìn)一步減少線粒體能量供應(yīng)和無(wú)功能的花粉生產(chǎn)。
2、保持系和不育系中線粒體基因組結(jié)構(gòu)的重排
根據(jù)四個(gè)線粒體基因組的同源序列和同義分析，分別在YY85，sYY85，ZY90和sZY90中發(fā)現(xiàn)了45、52、25和27個(gè)同源序列區(qū)域（同義嵌段）。在YY85/sYY85和ZY90/sZY90的同線區(qū)域中，有11個(gè)和9個(gè)共線性區(qū)域，24個(gè)和13個(gè)易位區(qū)域，3個(gè)和1個(gè)反向區(qū)域以及14和4個(gè)同時(shí)的反向和易位區(qū)域。在兩個(gè)煙草品種的不育系和保持系中，超過(guò)60％的同義嵌段被重排，并且線粒體基因組之間的同義嵌段順序存在顯著差異。
具體如下圖所示：
（橙色是正向鏈，藍(lán)色是反向鏈，方框中顏色深度表示相似，完全填充表示100%相似）
在煙草中，在煙草屬內(nèi)的各品種之間或煙草與茄科的其他屬之間產(chǎn)生了同質(zhì)系以及原生質(zhì)體融合，以獲得用于育種和遺傳研究的不育系。線粒體基因組的重排可能會(huì)產(chǎn)生新的嵌合ORF。大多數(shù)鑒定出的與CMS相關(guān)的基因是許多作物物種中的嵌合ORF，它們與編碼ATP合酶或細(xì)胞色素C氧化酶亞基（例如atp6和cox2）的基因融合。但是，尚未在煙草線粒體基因組中發(fā)現(xiàn)與CMS相關(guān)的嵌合ORF。這種現(xiàn)象表明，煙草中與CMS相關(guān)的基因與其他植物中的不同。在此次研究中，在兩個(gè)煙草品種的兩個(gè)CMS系中都鑒定出了特定的蛋白質(zhì)編碼基因和ORF，它們被認(rèn)為是煙草中與CMS相關(guān)的候選基因。
4、候選不育系相關(guān)基因atp6的蛋白互作驗(yàn)證（PPI）實(shí)驗(yàn)
根據(jù)以前的研究，對(duì)于所有候選CMS相關(guān)基因，ATP6和CMS之間的關(guān)系至關(guān)重要。尚未在煙草線粒體基因組中發(fā)現(xiàn)與CMS相關(guān)的嵌合ORF，因此擬南芥被選作PPI預(yù)測(cè)的相關(guān)物種。ATPase序列的比對(duì)結(jié)果表明，煙草與擬南芥的相似度超過(guò)70％。因此，推測(cè)該軟件預(yù)測(cè)的擬南芥的PPI結(jié)果可以更好地反映煙草的PPI趨勢(shì)。在預(yù)測(cè)所有ATPase蛋白的PPI后，結(jié)果清楚地表明ATP9可能與ATP6相互作用。因此，使用酵母雙雜交技術(shù)選擇了ATP6和ATP9來(lái)驗(yàn)證保持系和CMS系之間潛在的PPI關(guān)系差異。結(jié)果表明，保持系（圖C）中ATP6和ATP9的PPI弱于CMS系（圖B）。PPI強(qiáng)度的這種差異表明ATP6基因可能是關(guān)鍵基因之一，并且是與植物不育相關(guān)的重要因素。在未來(lái)的研究中，CMS相關(guān)的差異將突出ATP6，并進(jìn)一步擴(kuò)展到整個(gè)線粒體基因組，以發(fā)現(xiàn)更多可能在不育中發(fā)揮關(guān)鍵作用的關(guān)鍵基因。煙草線粒體基因組的全面研究有助于增進(jìn)我們對(duì)茄科作物不育機(jī)理的了解。
ATP6-ATP9酵母雙雜驗(yàn)證圖（A、陽(yáng)性對(duì)照；B、不育系；C、保持系）
對(duì)YY85，sYY85，ZY90和sZY90的線粒體基因組的綜合分析表明，廣泛的結(jié)構(gòu)變異可能與不育有關(guān)，更具體地說(shuō)，四個(gè)候選CMS特異性基因以及16個(gè)候選CMS特定的ORF與CMS機(jī)制密切相關(guān)。它們不僅代表了與CMS相關(guān)的候選基因，而且還可以用作鑒定煙草中CMS系的分子標(biāo)記。值得注意的是，針對(duì)ATP6的PPI實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步支持了該候選CMS特異性基因的重要性以及我們研究結(jié)果的有效性。線粒體基因組信息的獨(dú)立分析不足以揭示CMS機(jī)制。因此，迫切需要來(lái)自多組學(xué)研究的更多有價(jià)值的信息來(lái)進(jìn)行后續(xù)工作。
植物三系簡(jiǎn)稱三系。植物三系是指的雄性不育系，雄性不育保持系，雄性不育恢復(fù)系這三系。
不育系，不育系就是雄性不育系的簡(jiǎn)稱。是指植物的雄性器官退化或發(fā)育不正常,喪失了受精能力，自交不結(jié)實(shí)，但是雌蕊正常，可以接受其他植物品種的正常花粉可以結(jié)實(shí)的品系，所以稱為雄性不育系。
保持系，保持系就是雄性不育保持系的簡(jiǎn)稱。不育系本身沒(méi)有花粉，保持系不能結(jié)實(shí)，為了年年有大量的純不育系種子，每一個(gè)不育系必須有一個(gè)專門給它授粉，使所得的下一代仍為不育系的品系。這種使不育系能傳種接代的植物品系，稱為雄性不育保持系。
恢復(fù)系，恢復(fù)系就是雄性不育恢復(fù)系的簡(jiǎn)稱。保持系只能為不育系解決傳種接代問(wèn)題，不能解決生產(chǎn)上應(yīng)用的大量雜交種。必須用另一些特定品種給不育系授粉，使所得種子種出來(lái)的植株雄蕊恢復(fù)正常，并能自交結(jié)實(shí)，這些品種或品系，稱為雄性不育恢復(fù)系。
Ruyi Wang , Xunhui Cai , Shengnan Hu ,et al.Comparative Analysis of the Mitochondrial Genomes of Nicotiana tabacum: Hints Toward the Key Factors Closely Related to the Cytoplasmic Male Sterility Mechanism[J]. Frontiers in Genetics. 2020, 11:257-272.
