2020-07-06
烈日炎炎，暑期將至，空調可以抵御高溫的折磨，卻抵擋不住派森諾眾位客戶的熱情。目前派森諾轉錄組測序產品中，真核生物mRNA文庫構建的方式有兩種，分別是真核非鏈特異性轉錄組文庫（又稱普通轉錄組文庫）和真核鏈特異性轉錄組文庫，隨著轉錄組研究的不斷深入，真核鏈特異性轉錄組文庫越來越受到大家的青睞。那么問題來了，什么是“鏈特異”？為什么選擇“鏈特異”？何時選擇“鏈特異”？
今天小編就帶領大家一起細數一下“鏈特異”與“非鏈特異”文庫的那些事，相信看完你就能找到答案。
01、什么是鏈特異性轉錄組測序？
鏈特異性轉錄組測序（strand-specific RNA-seq）是指在構建測序文庫時，將轉錄本的方向信息保存到測序文庫中，測序后的數據分析可確定轉錄本是來源于基因組的正鏈或負鏈。與普通轉錄組測序相比，它更能準確地統計轉錄本的數量和確定基因的結構，同時可以發現更多的反義轉錄本，而這些反義轉錄本對基因的表達調控可能起非常重要的作用，此外還可能發現新的基因，對研究基因結構和基因表達調控都具有重要意義。
02、普通轉錄組文庫和“鏈特異”文庫區別
眾所周知，DNA是雙螺旋結構且具有正負鏈之分，通常將攜帶有編碼蛋白質氨基酸信息的核苷酸序列的鏈稱為正義鏈，另一條鏈核苷酸序列與正義鏈互補，稱為反義鏈。簡單來講，“鏈特異”文庫是以RNA反轉錄的cDNA一條鏈為模板進行PCR擴增構建的文庫，而普通轉錄組文庫是以RNA反轉錄的cDNA兩條鏈為模板進行PCR擴增構建的文庫。因此，普通轉錄組文庫無法區分RNA極性，而“鏈特異”文庫能夠有效區分RNA極性，這就是兩種文庫的區別所在。
03、如何實現“鏈特異”建庫？
與傳統普通轉錄組建庫相比，“鏈特異”建庫在實驗原理和操作步驟上又有何差異呢？目前，市面上“鏈特異”建庫方法有多種，而小編使用的是最普遍的dUTP法，即在合成cDNA第二鏈時用dUTP代替dTTP，然后在PCR富集之前使用UDG將含有U的DNA鏈水解掉，這樣就只有第一鏈保留下來，即可知道測序得到的轉錄本是來自于正義鏈還是反義鏈。話不多說，直接上圖比較一下普通轉錄組建庫和鏈特異建庫的流程差異：
PS、課外知識
dUTP法
又稱摻U法，首先使用常規的方法從RNA上逆轉錄出第一條cDNA鏈，然后在合成第二條cDNA鏈時，將加入的dNTPs中的dTTP替換為dUTP，使得合成出的第二條cDNA鏈中會摻入大量U堿基，隨后在雙鏈cDNA的兩頭接上接頭，最后在PCR擴增階段使用UDG酶特異性降解帶有U堿基的cDNA鏈，從而保證得到的轉錄組文庫保留其方向性。
UDG
尿嘧啶-DNA糖基化酶：Uracil-DNA Glycosylase，簡稱UDG，能夠特異識別DNA鏈中的尿嘧啶堿基（U），并且把U堿基進行糖基化，隨后將糖基化的U堿基從核酸鏈上切除，使核酸鏈上就生成一個缺堿基的空位，然后在脫堿基位點上降解核酸鏈，使得DNA不能再被DNA聚合酶復制，對RNA無活性，常被用于消除PCR擴增中的參與污染。
04、為何選擇“鏈特異”文庫？
從上面二者的操作步驟可以得知，普通轉錄組建庫無法確定RNA的方向性，對于反義轉錄本的發現、新基因功能注釋、基因結構分析及基因表達的精確計算均具有很大的限制，而“鏈特異”建庫可以保留RNA的方向性，測序時可以確定轉錄本來源于基因組的正義鏈或反義鏈，能夠很好的克服普通轉錄組測序的不足，基于此，鏈特異性建庫具有比傳統建庫更多優勢，包括：
（1）定量轉錄本表達量更精確
由于“鏈特異”文庫可以保留RNA的方向信息，因此在計算某些轉錄本的表達量時，可以排除來自其互補鏈上的轉錄本表達的干擾，使得基因定量更精準。
（2）可變剪切事件檢測更準確
鏈特異性文庫可以排除反義鏈上轉錄本的影響，使可變剪接事件的假陽性率降低。已知circRNA由反向剪切形成，在發掘新的circRNA時，鏈特異性的測序方式有助于提高circRNA檢測的準確率。
（3）提高非編碼轉錄本的檢出率，發掘潛在順式天然反義轉錄本
反義轉錄廣泛存在于真核生物中，且在發育、代謝等多種生物學過程中具有非常重要的調控作用。鏈特異性文庫可以提高反義鏈上非編碼轉錄本的檢出率，同時也便于確定哪些位于基因間的非編碼轉錄本的方向。
（4）更好預測原生生物操縱子（operon）
原核生物的基因為多順反子結構，如果對正反義轉錄本上的基因不加區分，那么對應位置的基因表達量會計算不準確，對操縱子以及基因結構的預測也更不準確。“鏈特異”文庫可更準確實現對操縱子鑒定與分析。
（5）轉錄本組裝更高效、真實
普通轉錄組組裝出來的unigene既包括編碼轉錄本，也包括一些非編碼轉錄本（如lncRNA），若不區分正反鏈，那么有互補配對關系的編碼與非編碼轉錄本會被組裝成一條轉錄本，所以“鏈特異”文庫可明確轉錄本的方向性，在進行無參轉錄本組裝時顯得很有必要。
05、何時選擇“鏈特異”文庫？
說了那么多，相信大家對鏈特異性文庫已經有了系統的了解，既然鏈特異性文庫有這么多好處，那么該何時將這些好處加以具體應用呢？為了更好地促進您的轉錄組研究，貼心的小編為大家整理了“鏈特異”文庫應用方向的思路參考，若您的轉錄組研究涉及到以下幾個方向（包括但不限于）：
（1）差異基因精準分析；
（2）原核生物操縱子分析；
（3）模式生物結構分析。
不妨果斷選擇派森諾真核鏈特異性文庫，其優越的性能和廣泛的應用定將不負所望！
