2020-06-30
三十而立，在短短的三十幾年里，經歷從無到有，從質疑到認可，從寂寂無名到炙手可熱，CRISPR-Cas技術可以說是目前生命科學領域發展迅速的技術了。
它究竟是怎么回事？
是怎么一步一步發展起來的？
為什么這么火？到底怎么用呢？
今天小編就給大家簡單的科普一下。
圖1 歷年CRISPR相關文獻統計
基因編輯技術是一種能夠對生物體的基因組及轉錄產物進行定點修飾或者修改的技術，早期基因編輯技術包括歸巢內切酶(homing endonuclease, HEs)、鋅指核酸內切酶（zinc finger endonuclease, ZFN）和類轉錄激活因子效應物(transcription activator-like effector nucleases, TALENs)，但脫靶效應和組裝復雜性限制了這些技術在基因編輯領域的應用。CRISPR-Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated proteins)系統最初在大腸桿菌基因組中被發現，是細菌中抵抗外源病毒的免疫系統。CRISPR-Cas9系統由兩部分組成，一部分是用來識別靶基因組，長度為20bp左右的sgRNA序列，另外一部分是存在于CRISPR位點附近的雙鏈DNA核酸酶——Cas9，能在sgRNA的引導下對靶位點進行切割，最終通過細胞內的非同源性末端連接機制（NHEJ）和同源重組修復機制（HDR）對形成斷裂的DNA進行修復，從而形成基因的敲除和插入，最終實現基因的（定向）編輯。
與前兩代技術相比，憑借著成本低廉，操作方便，效率高等優點，CRISPR/Cas9迅速風靡全球的實驗室，成為了生物科研的有力幫手。CRISPR-Cas9技術最大的突破是不僅可以對單個基因進行編輯，更重要的是可以同時對多個基因進行編輯，這也為全基因組篩選提供了有效的方法。
CRISPR簇是一個廣泛存在于細菌和古生菌基因組中的特殊DNA重復序列家族，充當了防御外源遺傳物質的“基因武器”。CRISPR是—成簇的規律間隔的短回文重復序列，分布在40%的已測序細菌和90%的已測序古菌當中。圖2展示了完整的CRISPR位點的結構。其中，CRISPR序列由眾多短而保守的重復序列區（repeat）和間隔區（spacer）組成。重復序列區含有回文序列，可以形成發卡結構。而間隔區比較特殊，它們是被細菌俘獲的外源DNA序列。這就相當于細菌免疫系統的“黑名單”，當這些外源遺傳物質再次入侵時，CRISPR/Cas系統就會予以精確打擊。而在上游的前導區（leader）被認為是CRISPR序列的啟動子。另外，在上游還有一個多態性的家族基因，該基因編碼的蛋白均可與CRISPR序列區域共同發生作用。因此，該基因被命名為CRISPR關聯基因（CRISPR associated，Cas）。目前已經發現了Cas1-Cas13等多種類型的Cas基因。Cas基因與CRISPR序列共同進化，形成了在細菌中高度保守的CRISPR/Cas系統。
圖2 CRISPR位點結構圖
CRISPR/Cas9系統的工作原理可以概括為以下幾步：
1、外源DNA俘獲并添加到基因組的CRISPR序列之中。
2、CRISPR座位轉錄形成前體crRNA(crisprRNA)；
3、Pre-crRNA經過剪接形成成熟的crRNA；
4、crRNA、tracrRNA與Cas蛋白結合，引導Cas蛋白到達目標區域；
5、Cas蛋白剪切目標片段，形成雙鏈斷裂（DSB）；
6、細胞的修復機制啟動，修復DNA，引入突變。
圖3 CRISPR工作原理圖
當sgRNA靶向單基因時，CRISPR可視為一種高效的基因編輯工具。但當sgRNA靶向全基因組序列時，CRISPR便升級為一種全基因組篩選的工具。基于CRISPR/Cas9篩選的一般流程如下（圖4）：
1、構建靶向全基因組的基因敲除文庫(genome-scale CRISPR-Cas9 knockout, GeCKO)或激活基因sgRNA文庫；
2、包裝慢病毒文庫；
3、以低MOI感染細胞，使sgRNA整合到細胞基因組上，隨基因組DNA的復制而復制；
4、用抗生素篩選出感染病毒的細胞；
5、根據表型(耐藥性、增殖能力、存活能力、標記基因等)選擇細胞；
6、提取細胞核基因組；
7、建庫，進行二代測序；
8、利用生物信息學分析獲得目的基因。
圖4 sgRNA文庫篩選流程圖
1、藥物靶點確定與驗證
CRISPR-Cas9篩選技術可以應用于藥物靶點篩選中，通過大規模篩選技術，可以系統的分析、驗證一些與抗藥性相關的基因，從而為疾病治療提供相關數據。美國加州大學圣地亞哥分校的研究人員在國際頂尖學術期刊Nature子刊Nature Cancer期刊上發表的題為“An in vivo genome-wide CRISPR screen identifies the RNA-binding protein Staufen2 as a key regulator of myeloid leukemia”的研究論文，研究人員使用CRISPR技術在白血病細胞中進行全基因組篩選，并識別出了侵襲性慢性髓系白血病的關鍵調節因子——Staufen2，該分子或可成為治療慢粒白血病的新靶點。
2、基因環路上下游調控機制分析
CRISPR-Cas9文庫篩選技術不僅可以用于編輯人類細胞蛋白編碼基因，對于基因組中的調控元件也同樣有效，利用這種方法可以對基因環路上游有調控機制進行分析。在Nature上發表題為“CRISPR screen in regulatory T cells reveals modulators of Foxp3”的文章，通過在小鼠Treg細胞中進行CRISPR篩選，發現了新的影響Treg中Foxp3蛋白穩定性的調控因子Usp22和Rnf20，并闡述了其中機制。
3、代謝通路調節機制分析
CRISPR-Cas9技術在人體代謝調控中也有相關成果。來自美國哈佛大學醫學院、霍華德休斯醫學研究所、Broad研究所及麻省總醫院Vamsi Mootha實驗室的研究人員在Cell雜志上在線發表了題為“Genetic screen for Cell Fitness in High or Low Oxygen Highlights Mitochondrial and Lipid Metabolism”的研究論文，通過CRISPR篩選技術，系統鑒定了人體基因和通路水平對高低氧環境(即21%、5%及1%O2)的細胞健康(cell fitness)水平的變化，揭示了參與氧感受、代謝的基因及通路。
4、Long noncoding RNA作用機制分析
CRISPR-Cas9文庫的建立可以實現基因組的大規模篩選，為了對非編碼基因的功能進行驗證，Nature biotechnology發表文章“Genome-scale deletion screening of human long non-coding RNAs using a paired-guide RNA CRISPR-Cas9 library”提出構建了psgRNAs文庫的方法，這種成對的sgRNA可在同一基因中造成兩處斷裂，形成大片段缺失，從而影響表型變化，成為研究非編碼基因的重要方法。使用慢病毒psgRNA文庫，對人源肝癌細胞系Huh7.5OC進行基因組的700個lncRNA和另外5種癌癥細胞進行敲除實驗，最終篩選到51個lncRNA基因能夠促進或者抑制腫瘤的生長。
介紹到這里，大家是不是已經折服于CRISPR的巨大魅力和無限潛力了呢？是不是感覺高分文章在向您招手呢？
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