2020-06-29
DNA、RNA和蛋白質(zhì)是三種重要的生物大分子，是生命現(xiàn)象的分子基礎(chǔ)。DNA的遺傳信息決定生命的主要性狀，而mRNA在信息傳遞中起著重要的作用。其他兩大類RNA，即rRNA和tRNA同樣在蛋白質(zhì)的生物合成中發(fā)揮著不可替代的功能。因此RNA在DNA和蛋白質(zhì)中間起著中介的作用，其重要性不言而喻。
在研究RNA的分子實驗中，獲得高質(zhì)量的RNA至關(guān)重要，但是有些樣本因為細(xì)胞結(jié)構(gòu)特殊、代謝產(chǎn)物極其豐富、本身RNA豐度低等因素，影響到RNA提取質(zhì)量。另外，由于RNA酶的廣泛存在并難以消減的頑強(qiáng)特性，使得RNA的抽提純化更為困難。
那么今天我們針對RNA提取相關(guān)知識展開簡短的介紹~
一、RNA提取原則
(1) 保證RNA分子的完整性
(2) 排除DNA分子的污染
(3) 排除有機(jī)溶劑、金屬離子、蛋白質(zhì)、多糖、多酚、脂類的污染
(4) 獲得足量的核酸
(5)方法操作簡便，穩(wěn)定性強(qiáng)
不同組織中RNA豐度示意圖
二、RNA種類
有mRNA、rRNA、tRNA、LncRNA、circRNA、miRNA、piRNA、siRNA等
三、RNA提取注意事項
1、操作環(huán)境干凈無灰塵，嚴(yán)格戴好口罩、手套等。
2、實驗所涉及的離心管、槍頭、移液器、電泳槽、實驗臺面等要用RNase抑制劑徹底處理。
3、實驗所涉及的試劑、溶液，尤其是水必須確保RNase-Free。
4、選擇合適的勻漿方法。
5、選擇合適的裂解液。
6、控制好樣品的起始量。
7、控制好裂解液與樣品量的比例。
8、RNA抽提成功的唯一經(jīng)濟(jì)標(biāo)準(zhǔn)是后續(xù)實驗的一次成功，而不是得率。即綜合RNA的得率和純度。
四、RNA提取原理及常用方法問題
1、 RNA提取原理
RNA提取步驟，大致可分為裂解和純化。首先對樣品裂解，采用機(jī)械力、化學(xué)試劑等方法將RNA釋放出來，隨后去除蛋白質(zhì)、糖、酚、金屬離子等雜質(zhì)，再用無水乙醇、異丙醇沉淀或載體吸附RNA，之后洗滌溶解即可得到核酸。
2、RNA提取常用方法
異硫氰酸胍/苯酚法（如Trizol法）
試劑盒過柱法
磁珠法
改良方法
3、RNA提取過程中常見問題
五、幾種難提取樣本案例
以上介紹了RNA提取中的一些小知識點(diǎn)，那么接下來我們簡單列舉幾種特殊樣本的采集要求及提取結(jié)果~
1、全血樣本
樣本采集：一般是抗凝血與TRIzol LS按體積1:3的比例混勻，立即液氮速凍15min以上，隨后-80℃保存，送樣量不低于3mL。
獨(dú)特優(yōu)勢：實驗室在原有TRIzol的提取方法上進(jìn)行改良，提取的得到的RNA純度和得率較正常TRIzol法效果更佳。
結(jié)果對比：
2、植物樣本
樣本采集：在活體狀態(tài)下擦凈組織表面灰塵和雜質(zhì)（盡量選擇幼嫩組織），隨后取樣，迅速放入預(yù)冷好的已寫好編號的RNase-free的螺紋凍存管中，立即液氮速凍15min以上，隨后-80℃保存。
2.1 淀粉含量高樣本（比如：水稻胚乳）
獨(dú)特優(yōu)勢：公司擁有發(fā)明專利的CTAB+TRIzol改良法，能有效去除淀粉、得到高純度高質(zhì)量的RNA。
結(jié)果對比：
2.2 多糖多酚類樣本（比如：茶葉）
獨(dú)特優(yōu)勢：對現(xiàn)有試劑盒進(jìn)行改良，加入前處理后，提取核酸純度有明顯提升，利于后續(xù)的建庫測序和分析。
結(jié)果對比：
2.3 油脂含量高樣本（比如：油菜籽）
結(jié)果展示：
結(jié)果展示：
圖為干燥的苦蕎種子提取檢測結(jié)果
3、動物樣本
樣本采集：快速從動物活體取材獲得組織后，立即用預(yù)冷的RNase-Free 水進(jìn)行漂洗，以去除血漬和污物，迅速將組織放入預(yù)冷的RNase-Free帶螺旋帽的 2.0 mL的凍存管中，立即液氮速凍15min以上，隨后-80℃保存。
3.1 脂肪組織
脂肪組織單位體積內(nèi)細(xì)胞數(shù)少，且單位細(xì)胞內(nèi)RNA含量相對較少，這增加了從脂肪組織提取RNA的難度，對于脂肪組織，需要客戶加大送樣量，送樣量應(yīng)為常規(guī)樣本量的3-4倍。公司有專門針對脂肪組織的提取方法，所提取得到的RNA純度較高，完整度好。
結(jié)果展示：
圖為小鼠脂肪組織提取檢測結(jié)果
3.2 軟骨組織
軟骨組織中含有大量的水分和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，軟骨細(xì)胞只占整個組織重量的3%左右，并且軟骨細(xì)胞又被大量軟骨基質(zhì)所包裹，細(xì)胞不易從基質(zhì)中分離出來，這樣在常規(guī)硫氰酸胍法提取中相當(dāng)數(shù)量的軟骨細(xì)胞仍被在基質(zhì)包裹中，未能從基質(zhì)中分離出來，由此造成RNA得率很低；另外基質(zhì)糖蛋白與RNA會形成共沉淀，使RNA難以被進(jìn)一步純化。目前公司在現(xiàn)有試劑盒的方法上進(jìn)行改良，增加前處理，得到的RNA純度和總量能滿足后續(xù)的常規(guī)建庫需要。
結(jié)果展示：
圖中為雞軟骨組織提取檢測結(jié)果
