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干貨 | 微量基因組建庫(kù)方案介紹

2020-06-19

長(zhǎng)久以來，困擾著無數(shù)科研人員的難題之一就是樣本總量不足。很多時(shí)候，有了好的想法，但樣本的獲得卻受諸多條件的限制，比如樣品珍貴、樣品來源稀缺、組織大小本身受限、或者含量極少的微生物、細(xì)胞等等。對(duì)于此類樣本，想進(jìn)行基因組測(cè)序是非常困難的。

在保留傳統(tǒng)測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建優(yōu)勢(shì)的基礎(chǔ)上，我們不斷優(yōu)化建庫(kù)流程，力求用較少的樣本獲得較高的文庫(kù)轉(zhuǎn)化效率。以往常規(guī)全基因組PE建庫(kù)一次投入的DNA總量需要500ng以上，隨著實(shí)驗(yàn)方案的不斷優(yōu)化，現(xiàn)在我們能夠做到以300ng起始建庫(kù)。

但即便如此，仍然會(huì)有很多老師的樣本無法滿足建庫(kù)要求。針對(duì)此種情況，我們進(jìn)一步改進(jìn)建庫(kù)方案，目前派森諾已有兩套完善有效的微量建庫(kù)方案可以對(duì)最低5ng起始量的DNA進(jìn)行常規(guī)PE文庫(kù)構(gòu)建。

本文就帶大家了解下我們?nèi)峦瞥龅膬煞N微量建庫(kù)方案：

一種是先通過全基因組擴(kuò)增（whole genome amplification, WGA）無序列傾向性的富集基因組DNA，隨后進(jìn)行正常建庫(kù)；另一種是對(duì)微量DNA直接建庫(kù)測(cè)序。

1.1、微量擴(kuò)增方案

全基因組擴(kuò)增指的是對(duì)全基因組通過擴(kuò)增的方法增加DNA的總量。目前有很多種可用于全基因組擴(kuò)增的技術(shù)方法，總體有兩類，一類是基于熱循環(huán)PCR的擴(kuò)增方式如LA- PCR（linker adaptor PCR）、T- PCR（Tagged PCR）、DOP- PCR（degenerate oligonucleotide- primed PCR，）等；另一類則是不依賴PCR擴(kuò)增的方法如多重鏈置換擴(kuò)增（Multiple Displacement Amplification, MDA）等。

第一類方法由于用到熱循環(huán)PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增過程中存在一定程度的偏好性，最終擴(kuò)增結(jié)果對(duì)全基因組的覆蓋度有限并造成部分區(qū)域相對(duì)增多，且這類方法常用到Taq DNA聚合酶，擴(kuò)增長(zhǎng)度很難超過3K、保真性有限。

多重置換擴(kuò)增(MDA)是1998年由耶魯大學(xué)Lizardi博士首次提出。這種恒溫?cái)U(kuò)增的方法依賴于鏈置換擴(kuò)增原理，利用噬菌體Phi29 DNA聚合酶，高度擴(kuò)增DNA。該酶具有極強(qiáng)的模板結(jié)合能力，能克服很多DNA復(fù)雜結(jié)構(gòu)如發(fā)卡環(huán)等，連續(xù)擴(kuò)增100kb的DNA模板而不解離；同時(shí)這種酶具有極強(qiáng)的3’-5’外切酶活性，其保真度是Taq酶的1000倍。Phi29 DNA聚合酶強(qiáng)大的延伸活性和高保真度使得通過MDA可從極少量的DNA樣本獲取大量高質(zhì)量的DNA（通常以5ng起始最終能得到5-20ug的DNA），MDA擴(kuò)增產(chǎn)物可達(dá)到95%以上的覆蓋度，擴(kuò)增產(chǎn)物大小平均大于20 kb，可廣泛適用于全基因組和外顯子測(cè)序、大片段拷貝數(shù)變異分析、微衛(wèi)星分析、qPCR分析、基因芯片分析，是目前為止對(duì)整個(gè)基因組覆蓋最廣、各位點(diǎn)擴(kuò)增偏好最小的WGA方法。

MDA主要用到phi29 DNA聚合酶和硫代修飾的六堿基隨機(jī)引物。在恒溫條件下，隨機(jī)引物在多個(gè)位點(diǎn)與模板退火，隨后在phi29 DNA聚合酶作用下啟動(dòng)復(fù)制反應(yīng)；沿模板合成的新鏈在延伸過程中從模板中置換出下游已復(fù)制的DNA鏈，被置換出的DNA鏈又作為新的模板，在phi29 DNA和隨機(jī)引物的作用下繼續(xù)合成新的DNA鏈直至引物和原料耗盡達(dá)到擴(kuò)增反應(yīng)的最大濃度（如圖一所示）。最終得到的DNA可以直接用于后續(xù)分子實(shí)驗(yàn)。

圖片1.png

圖一 MDA反應(yīng)示意圖

1.2、全基因組DNA直接微量建庫(kù)方案

MDA能得到高質(zhì)量的可直接用于建庫(kù)的DNA，但也有其局限性。第一，MDA對(duì)模板的靈敏度極高，提取到的DNA或者在MDA擴(kuò)增中如果有任何輕微異源污染都會(huì)在后續(xù)擴(kuò)增中成倍放大，所以其對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)階段要求極高。第二，目前雖然有95%的覆蓋率和高保真性，但和直接提取的DNA仍然有一定的區(qū)別。第三，MDA方案對(duì)DNA的完整性和純度有極高的要求；如果完整度和純度不足，擴(kuò)增后會(huì)存在部分染色體錯(cuò)位或等位基因丟失的現(xiàn)象，這對(duì)提取的要求就會(huì)很高。通過優(yōu)化MDA的實(shí)驗(yàn)方案能夠在一定程度上改善這些問題，但直接將原始DNA用于后續(xù)建庫(kù)測(cè)序?qū)嶒?yàn)顯然是更有效的方案。

根據(jù)以往優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中積累的大量經(jīng)驗(yàn)，我們開發(fā)了一套派森諾獨(dú)有的直接以極低起始量DNA為模板進(jìn)行建庫(kù)的方案。經(jīng)過大量實(shí)際上機(jī)測(cè)試，微量建庫(kù)結(jié)果與高起始量的常規(guī)建庫(kù)結(jié)果高度一致。

使用相同樣品（水稻葉片）同時(shí)使用兩種方案建庫(kù)：300ng起始量和5ng起始量建庫(kù)上機(jī)。我們分別從文庫(kù)質(zhì)量、下機(jī)數(shù)據(jù)質(zhì)量、與參考基因組比對(duì)率幾個(gè)方面進(jìn)行比較兩種建庫(kù)方案。

1.2.1、文庫(kù)質(zhì)檢

對(duì)文庫(kù)分別用qubit（ng/ul）和qPCR（nM)兩種方式定量，使用labchip對(duì)文庫(kù)的大小檢測(cè)（表一、圖二、圖三所示）。根據(jù)質(zhì)檢結(jié)果，兩種方案最終文庫(kù)質(zhì)量基本一致，文庫(kù)大小均集中在500bp左右。

表一文庫(kù)濃度詳表

圖二微量文庫(kù)labchip檢測(cè)結(jié)果

圖三常規(guī)文庫(kù)labchip檢測(cè)結(jié)果

1.2.2、下機(jī)數(shù)據(jù)質(zhì)量比較

將兩種文庫(kù)同時(shí)測(cè)序，按照6G/樣上機(jī)，上機(jī)模式為Novaseq PE150。分別對(duì)兩個(gè)文庫(kù)的下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如表二所示。兩個(gè)文庫(kù)的下機(jī)數(shù)據(jù)量均在6G以上，N(%)比例、GC含量正常；Q30高，數(shù)據(jù)可信度高。

Sample：樣品名；

Reads Num.：Reads 總數(shù)；

Total Bases(bp)：堿基總數(shù)；

N(%)：模糊堿基所占百分比；

GC(%)：GC 含量；

Q20(%)：堿基識(shí)別準(zhǔn)確率在 99%以上的堿基所占百分比；

Q30(%)：堿基識(shí)別準(zhǔn)確率在 99.9%以上的堿基所占百分比。

表二測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

1.2.3、高質(zhì)量數(shù)據(jù)獲取

將原始下機(jī)數(shù)據(jù)（raw data）過濾生成高質(zhì)量序列（high quality data）。數(shù)據(jù)過濾的基本情況見表三。

Sample：樣品名；

Reads Num.：Reads 總數(shù)；

Total Bases(bp)：堿基總數(shù)；

N(%)：模糊堿基所占百分比；

GC(%)：GC 含量；

Q20(%)：堿基識(shí)別準(zhǔn)確率在 99%以上的堿基所占百分比；

Q30(%)：堿基識(shí)別準(zhǔn)確率在 99.9%以上的堿基所占百分比。

表三測(cè)序數(shù)據(jù)過濾統(tǒng)計(jì)

1.2.4、序列比對(duì)

將過濾后得到的高質(zhì)量數(shù)據(jù)比對(duì)到參考基因組上。序列比對(duì)結(jié)果統(tǒng)計(jì)見表四。

Sample：樣本名；

HQ reads：過濾后的高質(zhì)量 reads 數(shù)量；

Mapped reads：比對(duì)至參考基因組上的 reads 數(shù)量（包括單端比對(duì)和雙端比對(duì)）；

Mapping rate：比對(duì)率，比對(duì)至參考基因組上的 reads 數(shù)量占總 reads 數(shù)量的百分比。

表四序列比對(duì)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

根據(jù)下機(jī)數(shù)據(jù)結(jié)果對(duì)比顯示，兩種方案的文庫(kù)質(zhì)量、下機(jī)數(shù)據(jù)質(zhì)量基本一致，過濾后的高質(zhì)量數(shù)據(jù)在參考基因組上的比對(duì)率基本一致。除水稻等大型植物外，我們還對(duì)動(dòng)物、微生物、環(huán)境等多種不同類型樣本進(jìn)行建庫(kù)上機(jī)測(cè)試，微量方案和常規(guī)方案在文庫(kù)質(zhì)量、下機(jī)數(shù)據(jù)質(zhì)量等方面都保持一致，在此就不一一贅述~

以上便是派森諾對(duì)于低起始量模板的兩種建庫(kù)方案。微量擴(kuò)增方案對(duì)樣品和操作環(huán)境要求高，需要最大可能避免外源樣品的污染，這對(duì)取樣、提取、建庫(kù)環(huán)節(jié)都有著極高的要求。

全基因組DNA直接微量建庫(kù)優(yōu)勢(shì)在于使用了提取后的原始DNA，能保證微量建庫(kù)結(jié)果和正常高起始量建庫(kù)測(cè)序結(jié)果一致。

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