2020-06-08
蛋白質的相互作用是生命活動的基礎，一切生命活動幾乎都是通過蛋白質之間的相互作用而實現的。在生物體發育的不同階段，細胞分裂、分化的不同時期，都離不開蛋白質間的相互作用。近年，隨著分子生物學技術的發展，人們對基因的結構和功能的認識不斷加深，尤其是基因組研究的飛速進展，為揭示生命的奧秘提供了條件。然而，只憑借基因序列很難認識蛋白質的功能及在整個細胞中所處的位置和作用。
酵母雙雜交作為發現和研究在活細胞體內的蛋白質與蛋白質之間的相互作用的技術，在近幾年來得到了廣泛運用。酵母雙雜交系統是在真核模式生物酵母中進行的，研究活細胞內蛋白質相互作用，對蛋白質之間微弱的、瞬間的作用也能夠通過報告基因的表達產物敏感地檢測得到。它是一種具有很高靈敏度的研究蛋白質之間關系的技術。
酵母雙雜交系統是建立在人們對酵母轉錄因子GAL4的認識基礎上的。一個完整的酵母轉錄因子GAL4包括兩個彼此分離的但功能必需的結構域：位于N端1~174位氨基酸區段的DNA結合域（DNA-BD）和位于C端768~881位氨基酸區段的轉錄激活域(AD)。DNA-BD能夠識別位于GAL4效應基因的上游激活序列(UAS)并與之結合，而AD則是通過與轉錄機構中的其他成分之間的結合作用，以啟動UAS下游的基因進行轉錄。研究人員發現DNA-BD和AD單獨分別作用并不能激活轉錄反應，但是當二者在空間上極為接近時，則呈現完整的GAL4轉錄因子活性并可激活UAS下游啟動子，使啟動子下游基因得到轉錄。根據這一特性，后期實驗人員開發了兩種質粒，一種是BD質粒（含有GAL4的DNA結合域），另一種是AD質粒（含有GAL4的轉錄激活域）。如需驗證蛋白之間的相互作用，只需要將2種蛋白質（X/Y蛋白）分別構建出BD-X質粒載體和AD-Y質粒載體，將2個重組質粒載體共轉化至酵母體內表達。判斷通過報告基因表達與否，即可判斷兩蛋白之間是否存在相互作用。
酵母雙雜交原理圖
說了一些酵母雙雜的原理，那如何利用這個優勢呢，下面的話，就帶大家來看下具體是怎么應用的吧（具體參考Yeast two-hybrid screening for proteins that interact with PFT in wheat [2]）！
赤霉?。‵HB）是世界范圍內的毀滅性小麥疾病。而與小麥FHB抗性相關的是Fhb1上的成孔毒素（PFT）基因。在這項研究中，使用從小麥赤霉病菌感染的蘇麥3號小麥穗中提取的RNA構建了高質量酵母雙雜交文庫。PFT的凝集素結構域對酵母細胞沒有自激活和毒性，因此被用作誘餌來篩選Y2H文庫。通過篩庫獲得了與PFT相互作用的23種蛋白質，這些蛋白質主要參與泛素化過程，網格蛋白涂層組裝，氧化還原過程和蛋白質磷酸化。這些相互作用基因的表達模式通過實時定量PCR進行了驗證。這項研究闡明了PFT的蛋白質相互作用，并提出了有關小麥FHB抗性的PFT調控網絡。
高度抗FHB的蘇麥3號（培育條件：光照時間14h，室溫24℃；黑暗時間10h，室溫15℃。收集樣品立即在液氮中冷凍，然后保存在-80°C直至進一步使用。）
酵母生長性能的評估：PFT包含兩個結構域，一個是兩個凝集素結構域。另一個是ETX/MTX2蛋白結構域（圖A）。ETX/MTX2蛋白是有效的毒素，對活細胞構成潛在威脅。將全長PFT及其兩個結構域分別轉化到Y2HGold酵母菌株中，然后接種在缺乏亮氨酸（SD/-Leu）培養基上，僅含有凝集素的酵母細胞的生長域沒有被感染，但是與空載體對照相比，ETX/MTX2毒素的表達對酵母菌的生長有毒性作用（圖B）。
誘餌自激活的檢測：將載體pGBKT7，pCL1和pGBKT7-PFTa轉化到Y190酵母菌株中，然后將所得轉化體接種在帶色氨酸且含有酵母半乳糖苷酶發色底物（SD/-Leu）的SD培養基上。陽性對照pCL1菌落在SD/-Leu/X-α-Gal平板上變為藍色（圖2B），但與陰性對照一樣，pGBKT7-PFTa菌落也未變為藍色（圖2A，C），表明誘餌pGBKT7-PFTa在沒有獵物蛋白的情況下不能自主激活報告基因，因此它適合用來構建酵母文庫。
酵母文庫的構建：提取小麥穗的總RNA，并質檢總RNA是否完整、有無降解（圖3A）。為了獲得用于后續文庫構建的高質量cDNA，使用SMART技術（Clontech）合成了cDNA，并在1％瓊脂糖凝膠上通過電泳進行質檢分析（圖3B），使用Chroma Spin-1000色譜柱純化消除小cDNA片段（圖3C），然后轉移至pGADT7載體以構建酵母雙雜文庫。為了確定cDNA文庫插入片段的長度，隨機選擇了16個陽性克隆，并通過PCR擴增鑒定。結果表明插入的片段大小在0.5到2.25 kb之間（圖3D），Y2H庫可用于進一步研究。
PFT相互作用蛋白的篩選：將含有AD文庫和pGBKT7-PFTa的Y190酵母細胞涂布到缺陷型平板上進行第一次篩選，總共生長了212個克隆，分離并測序所有質粒的插入片段，鑒定出57個不同的基因。由于存在假陽性克隆，我們將質粒pGBKT7-PFTa和代表不同基因的57個質粒分別轉化到Y2HGold酵母細胞中。Y2HGold菌株由于自身無法合成His和Ade，所以無法在缺少兩種必需氨基酸的培養基上生長。當誘餌和獵物蛋白相互作用時，GAL4響應并誘導His3和Ade2基因進行表達，使細胞能夠生物合成這兩個氨基酸，并在–His–Ade基本培養基上生長。最后，通過篩選鑒定了代表不同基因的23個陽性克隆（圖4），并使用NCBI數據庫和UniProt數據庫對克隆測序結果進行比對分析，這樣可獲得具體對應的蛋白類型。
文獻引用：
[1] Stanley Field&Ok-kyu Song, a noval gentic system of detecting protein-protein instractions[J]. Nature, 1989.
[2] Yi He1, LeiWu1, Xiang Liu2,et al.Yeast two-hybrid screening for proteins that interact with PFT in wheat [J]. Scientific Reports. 2019, 9:15521.
