2020-06-01
研究菌群多樣性組成譜主要是以細菌/古菌 16S rRNA基因可變區、真菌 18S rRNA 基因可變區或真菌 ITS（Internal transcribed spacer）內轉錄間隔區等微生物特征序列（Signature sequence）為靶點，通過檢測序列的變異和數量，反映菌群中各類微生物物種的身份和豐度，從而快速解碼菌群物種分布特征，闡明樣本間多樣性和組成差異，進而發現差異相關物種。菌群的物種分布與所取得的樣本有很大的相關性，所以樣本的收集和處理環節對后續的結果至關重要，今天主要來聊下針對不同的樣本有什么樣不同的取樣策略。
取樣前要做哪些準備呢？
不同的樣本取樣時的準備會有差異，但是大部分都會涉及到如下：
1. 取樣用品準備：由于所取樣本不同，需要準備的取樣器材不同，包括但不局限于經過滅菌的采血管、鑷子、EP管、鏟子等。
2. 取樣前對樣本的處理：若是固體整塊的樣本，建議用無菌器材切取有代表性的部分；若是液體樣本，建議混勻后取樣；若是粉末樣本，建議邊取邊混等，確保樣本的均勻性。
3. 取樣前或取樣后：在盛有樣本的容器上做好標記，密封，適當溫度保存。
土壤污泥類樣本要怎么取樣？
1. 根據研究目的確定采樣范圍，去除表面浮土，挖取地下5~20cm的土層。
2. 去除可見雜質，土壤過2mm篩網，每個樣品從3個及以上采樣點采集并混合而成，每1～5g分為一份袋裝保存；或取200-500mg分裝到2ml滅菌EP管中，足夠滿足一次實驗需求，同時根據實驗要求做好備份；避免運輸過程中樣品出現散漏等異常情況，置于低溫保存。
3. 污泥樣品在取樣時，需直接混勻；沙土類微生物含量相對少，可以多備些樣本，每5～10g為一份，袋裝保存。
糞便類樣本要怎么取樣？
一、人類糞便
方法一：
1. 準備好便盆或糞便容器，洗手，帶上手套收集新鮮的糞便樣本，糞便樣本中盡量無尿液。
2. 用無菌牙簽或糞便取樣器截取樣品中段里部（糞便表層含有腸粘膜脫落細胞），外部容易污染，且接觸空氣后，部分細菌 DNA 開始降解。
3. 用滅菌離心管每管稱取約0.2g左右糞便樣本，每個樣本取多管備份。
4. 分裝好后，若當天提取DNA，可以先放4°C，長期存放需先迅速放入液氮中，之后立即放入-80°C保存。
方法二：（推薦）推薦使用等分析管技術
1. 將糞便直接排便到無菌容器中，如果有條件，可當場進行后續操作，如果沒條件可將樣本在低溫下運輸，收集后48小時運輸到實驗室操作。
2. 使用吸管在糞便中反復插入，直到用均勻的混合物和最小的氣穴填充吸管；若在糞便樣品太軟或水分太多而無法填充吸管的情況下，使用無菌1ml注射器。吸管或者注射器有刻度，每次能確保取樣量相同。
提示：取樣最好在生物安全柜中進行。
二、小鼠糞便
分別收取目的小鼠的糞便，立即進行收取，盡量不要暴露在空氣中太長時間，避免污染和降解。
水體怎么取樣？
1. 根據研究目的確定采樣深度和范圍。
2. 采集好的水樣需要通過濾膜進行過濾，可以根據水樣的渾濁程度選擇相應孔徑的濾膜（清亮水樣：可選擇小孔徑的濾膜，一般選0.22μm或0.45μm的濾膜，過濾水樣體積大 于10L；渾濁水樣：過濾前靜置分離懸浮顆粒，也可以用大孔徑的濾膜預過濾一遍，再用小孔徑的濾膜進行過濾）。
3. 根據實驗需要做好備份，同時將濾膜-80℃保存備用。
食品類樣本怎么取樣？
1. 小包裝類樣品盡可能取原包裝，直到實驗前不要開封，以防污染。
2. 固體類樣品最好在不同部位采樣，一起放入滅菌離心管或者其他無菌容器保存。
3. 液體類樣品，取樣前盡量搖動混勻，放入15ml滅菌離心管，不要超過體積的四分之三，防止曝管。
研究表面微生物的應該怎么取樣？
1. 對于形狀較小的物體，直接將其放入無菌的容器中，加入PBS進行沖洗，振蕩使微生物脫落到PBS中；取液體放入滅菌離心管，-80℃保存備用。
2. 對于大的物體建議采用無菌棉簽沾取無菌水擦拭物體表面取樣，擦拭時在表面緩慢旋轉涂抹擦拭幾次，建議多擦拭幾個拭子；或用無菌手術刀片輕輕刮取物體表面取樣，將棉簽或刮取物放入滅菌離心管，-80℃保存備用。
研究植物內生菌應該怎么取樣？
1. 用流水沖洗植物根樣本表面并摘掉小側根，粘根土壤顆粒等以后對樣本進行化學消毒（95%的次氯酸鈉最少2min）。
2. 把樣本放入含有無菌玻璃珠的無菌水中劇烈搖晃，物理去除表面細菌。
3. 取出樣本后用手術刀片劃開根部表面，切取內部組織。
4. 把切取后的組織放入含有無菌玻璃珠的9%的生理鹽水中振蕩，在30℃的條件下振蕩4h以分離內生菌。
5. 用5μm濾膜過濾，15000rpm，4℃離心收集沉淀，長期存放需先迅速放入 液氮中，之后立即放入-80°C保存。
血液樣本怎么取樣？
1. 采集新鮮血液于含有EDTA的抗凝管中；顛倒數次混勻血液和EDTA。
2. 常溫3000rpm離心15min，棄上層血漿。
3. 下層血細胞分裝到EP管內，并標記好樣品名稱和日期保存在-20℃冰箱。
環境樣本怎么取樣？
1．自然沉降法：利用空氣微生物顆粒的重力作用，在一定時間內，讓所處區域的微生物顆粒逐步沉降到收集器皿（不推薦）。
2．使用各類抽氣裝置，針對實驗目的空氣微顆粒，用不同孔徑大小的無菌濾膜篩選目的顆粒，多次收集備用；將含顆粒過濾膜裝入無菌鋁箔內，密封在-80℃長期保存。
口腔樣本怎么取樣？
一、唾液樣本
1. 取樣前30分鐘，無進食、吸煙等動作。
2. 采樣之前要用雙手按摩臉頰兩側，盡可能的用舌頭多刮幾次上下顎，同時也可以用牙齒稍微的刮一下舌頭，保證脫落細胞的數量，使唾液流入唾液采集管中。
二、口腔內組織樣本
1. 口腔內組織的取樣建議用樣本采集拭子，確保在所要取樣部分反復擦拭最少10秒。
2. 采集后的拭子放入無菌管低溫保存。
呼吸道樣本怎么取樣？
一、上呼吸道
建議鼻拭子或者咽拭子，放保存液中保存。
二、下呼吸道
推薦支氣管鏡取樣：內窺鏡伸到氣道中的“楔子”，徐徐滴入生理鹽水，再抽吸出來并捕獲。保存在滅菌離心管-80℃備用。
三、痰液
盡量少帶唾液，獲得痰液后可以加入二硫蘇糖醇來稀釋樣本。
腸道內容物怎么取樣？
1. 在實驗對象死亡后，用無菌解剖刀，在無菌狀態下取出整個腸道，切取所需腸段的內容物（條件允許的話，可在無菌操作臺進行）。
2. 用無菌手術刀挖取內容物，立即放在冰上進行分裝并標記。
3. 用滅菌離心管分裝，單個樣本取樣量：0.2-0.5g/管。為保證實驗順利進行，每個樣本取多管備份，在采樣允許的情況下，盡量多采集樣品。
