2020-02-17
最近新型冠狀病毒肆虐嚴重，眾多做科研的寶寶們是不是都乖乖守在家中無聊著呢？這個時候，派森諾給大家送來學習干貨，提供“精神食糧”。
根據前文表觀遺傳學研究你知道多少？——ATAC-seq（點擊查看）可知，開放染色質的研究，對于尋找轉錄前調控核心因子至關重要。本次小編重點給大家介紹幾種利用現有測序技術快速獲取開放染色質區域的全部信息。
1、直接的開放染色質區域檢測技術——DNase-seq技術
2008年面市的DNase-seq技術是比較早出現的，基于二代測序平臺的開放染色質區研究技術。該技術使用核酸內切酶DNase I。此種酶類無法酶切被核小體或其他蛋白保護的DNA片段，優先切割開放染色質區域，因此開放染色質區通常也是DNase I的超敏感位點。對于此類核酸內切酶，只要酶切條件控制得當（例如酶切時間，溫度，酶的濃度等），開放染色質區不會被DNase I酶切成單堿基狀態，而只是將開放區DNA酶切成片段，為后續的測序工作和分析環節提供可能。但是該技術存在明顯的不足：
a需要大量細胞
b樣本制備耗時
c需要精確控制酶切條件，實驗復雜
實驗流程
DNase I酶切 ——收集酶切后片段（開放染色質區）——建 庫 ——上機測序
2、間接的開放染色質區域檢測技術——MNase-seq技術
2008年面市的MNase-seq是使用微球菌核酸酶（microccocal nuclease，MNase）這種同時兼具內切和外切酶活性的核酸酶。我是科普小貼士：凡是能水解核酸的酶都稱為核酸酶。凡能從多核苷酸鏈的末端開始水解核酸的酶稱為核酸外切酶，凡能從多核苷酸鏈中間開始水解核酸的酶稱為核酸內切酶。因為兼具外切酶和內切酶的活性，MNase能逐漸一步一步的切碎不被核小體或其他蛋白保護的DNA，只有被核小體或其他蛋白保護的DNA不被酶切降解。所以該技術主要用于核小體位置研究，開放區信號本身是缺失的（被酶切完全降解，測序檢測不到）。因此，MNase-seq技術只能間接檢測開放染色質區，該技術存在其他明顯的不足：
a需要的細胞數量較多，約10-20百萬個；
b樣本制備費時；
cMNase酶偏好切割基因組中AT富集區域；
d基因組的某些區域比其他區域對該核酸酶消化更敏感，但具體的機制目前仍不清楚。
實驗流程
MNase酶切——收集酶切后片段（核小體外DNA）——建 庫 ——上機測序
3、局限的開放染色質區域檢測技術——ChIP-seq技術
ChIP-seq技術是將ChIP與第二代測序技術相結合的ChIP-Seq技術，能夠高效地在全基因組范圍內檢測與組蛋白、轉錄因子等互作的DNA區段。該技術僅支持研究目標蛋白在基因組DNA上的開放染色質結合位點序列研究，要求有明確感興趣的目標蛋白，其次是該目標蛋白有較為成熟的chip4.級別的抗體，因此可使用該技術的物種和蛋白類型非常有限；另一方面，由于免疫共沉淀實驗的復雜性，需要較長的時間摸索實驗條件，以期實驗的成功和獲得足量的DNA片段進行測序和分析，因此ChIP-seq被認為局限的研究全基因組范圍內的開放染色質技術。
實驗流程
免疫共沉淀（ChIP）——富集目的蛋白——結合的DNA序列——純化DNA片段——建庫測序
4、高噪音但實驗相對簡單的開放染色質區域檢測技術——FAIRE-seq
FAIRE-seq是一種基于酚氯仿抽提原理為基礎的獲得開放染色質區的檢測技術。主要原理是使用超聲破碎經甲醛固定后染色質，得到片段化的的染色質，然后通過酚氯仿抽提，上層水相中即認為是潛在的開放染色質區，然后針對開放染色質區進行建庫測序，獲得開放區信息，但是該技術不足點在于：
a原本狀態的染色質結構復雜，超聲打斷DNA片段大小不易控制，因此檢測精度較差。
b非開放區噪音高，導致信噪比低，數據解讀困難，影響數據的可靠性
c甲醛固定時間不易把握
實驗流程
甲醛固定染色質 ——超聲波打斷——酚氯仿提取——富集上層水相DNA—— 建庫測序
5、較新較優的開放染色質區域直接檢測技術——ATAC-seq技術
2013年面市的ATAC-seq技術指的是利用DNA轉座酶可以把DNA序列從染色體的一個區域搬運到另一個區域的特性，用改造后的Tn5轉座酶，將轉座DNA設計為測序接頭，從而直接將測序接頭引入開放染色質中，進行捕獲測序。轉座酶主要切割的是基因組上的開放染色質區，而核小體致密排列的閉合染色質區，是無法被切割的。轉座酶切割后，對酶切DNA片段進行富集純化，就實現了對基因組開放區的獲取，另一方面，轉座酶還可以切割開放區染色質附近的核小體間連接區DNA，因此又可以同時獲得核小體印記信息。簡單言之，就是ATAC-seq技術可以同時得到DNase-seq和MNase-seq兩種技術的結果信息。
實驗流程
裂解細胞膜獲取細胞核——轉座與DNA純化——PCR擴增 ——定量與質控——上機測序
DNase-seq、FAIRE-seq和ATAC-seq實驗細胞起始量和實驗時間統計
DNase-seq、FAIRE-seq和ATAC-seq檢測結果信號統計
使用ATAC-seq技術研究開放染色質的
優勢總結
? 靈敏性高：低細胞起始量；
? 操作簡單，耗時短；
?實驗重復性好：技術重復間表現出非常好的可重復性( R = 0.98) ，并與DHS 測序數據間也有著較好的一致性(R＞0.79)；
?能同時揭示開放染色質的基因組位置，DNA結合蛋白，轉錄結合位點的相互作用
通過上述的說明和比較，現在大家知道研究開放染色質區域該選用哪一種檢測技術了嗎？ATAC-seq，你值得擁有~不論風里雨里，派森諾在這里等你。
貼心小貼士：疫情期間，大家做好安全防護，少出門，勤洗手，多看書，多睡覺。
