轉(zhuǎn)錄組結(jié)果，你的QPCR為啥驗(yàn)證不上？
2019-02-14
轉(zhuǎn)錄組結(jié)果出來后往往會(huì)做QPCR驗(yàn)證，但結(jié)果驗(yàn)證不上就讓人苦惱了，下面咱們就好好分析一下驗(yàn)證不上的原因。
1. 基因選的是否合適？
首先，驗(yàn)證挑選的基因個(gè)數(shù)不能太少。其次，QPCR驗(yàn)證一般選擇轉(zhuǎn)錄組結(jié)果中的差異基因，差異倍數(shù)根據(jù)生物學(xué)重復(fù)數(shù)量可進(jìn)行調(diào)節(jié)，比如三個(gè)重復(fù)的需要差異在2倍以上，5-10個(gè)重復(fù)的差異倍數(shù)可以適當(dāng)降低，重復(fù)數(shù)大于10的也可以只考慮P值。另外，應(yīng)避免選擇表達(dá)量過低的基因。一般在有生物學(xué)重復(fù)的情況下，要求組內(nèi)三個(gè)生物學(xué)重復(fù)的read count >=10；FPKM值至少在一個(gè)組大于1。
2. 樣本選的有沒有代表性？
當(dāng)一個(gè)組的生物學(xué)重復(fù)比較多的時(shí)候，往往只會(huì)選取部分樣本做QPCR，但要注意同一基因在不同樣本個(gè)體間的表達(dá)也是有差異的，所以選擇的樣本就要求能代表組內(nèi)的整體情況，排除基因在樣本間的特異性。
3. 引物設(shè)計(jì)的是否合理？
在RNA-Seq中大多數(shù)基因會(huì)包含不止一個(gè)轉(zhuǎn)錄本，甚至有一些特別復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄本形式，如果設(shè)計(jì)引物不合理就會(huì)使QPCR結(jié)果不準(zhǔn)，還可能會(huì)有假基因的干擾。所以，QPCR的引物盡可能全都設(shè)計(jì)在基因的轉(zhuǎn)錄本共有外顯子上，別是某些特定轉(zhuǎn)錄本的；引物設(shè)計(jì)好以后可以到NCBI做Primer Blast，保證引物不會(huì)Blast到一些基因組上的假基因上，避免假基因表達(dá)的干擾。
4. 轉(zhuǎn)錄組和QPCR的RNA是同一批次嗎？
RNA表達(dá)具有時(shí)間和空間的特異性，所以不同時(shí)刻或者是同一時(shí)刻不同組織內(nèi)RNA表達(dá)的數(shù)目都有著較大的差別，不同批次樣品的RNA表達(dá)也會(huì)有所不同，而且即使是同一批樣本，保存時(shí)間與保存方式不同也會(huì)對(duì)RNA造成影響。因此做QPCR驗(yàn)證的RNA需要與做轉(zhuǎn)錄組的RNA來源保持一致，間隔的時(shí)間也盡量不要太久。
5. 樣品的關(guān)系是否弄反？
一般QPCR驗(yàn)證不上可能是部分基因驗(yàn)證效果不好，但如果QPCR結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組的結(jié)果很明顯不一致，絕大部分基因上下調(diào)關(guān)系相反，就要考慮樣品弄反的可能性?？赡苁寝D(zhuǎn)錄組實(shí)驗(yàn)分析中導(dǎo)致樣品弄反，也有可能是做QPCR過程中弄反了樣品，需要進(jìn)一步核實(shí)確定了。
除了以上提到的因素，QPCR實(shí)驗(yàn)操作要求也比較嚴(yán)格，否則是失之毫厘差之千里，所以千萬要注意。大家還需要知道，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與QPCR定量雖然都看基因表達(dá)，但是他們確實(shí)兩種不一樣的方法，會(huì)有很大概率的不一致，要做好心理預(yù)期。
新年伊始，這篇小軟文就教教大家在轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的QPCR驗(yàn)證中如何避避坑，告別驗(yàn)證煩惱。
