2018-10-24
發表期刊：Science
研究簡介
癌細胞的身份是通過形態學、組織背景和標記基因表達來定義的。單細胞轉錄組在mRNA的全面和定量讀取基礎上細化了細胞的身份。精細的細胞轉錄組分析可以揭示一個腫瘤細胞的起源以及支持惡性轉化的轉錄軌跡。
信使RNA編碼細胞功能并產生表型。在人類癌癥的背景下，它定義了惡性細胞的身份和腫瘤組織的多樣性。本文對來自人腎腫瘤和胎兒、兒科和成人腎臟正常組織的72501個腎腫瘤細胞進行單細胞轉錄組分析。將兒童腎母細胞腫瘤與特定的胎兒細胞類型進行匹配，為假設腎母細胞腫瘤是異常的胎兒細胞提供證據。在成人腎細胞癌中，鑒定出一個典型癌癥轉錄本，它與鮮為人知的近似復雜的上皮細胞亞型（subtype of proximal convoluted tubular cell）匹配。本文對腫瘤成分的分析確定了與癌癥相關的正常細胞。文章結果發現可以精確的進行人腎臟腫瘤的鑒定和組成識別。
研究方法
方法平臺：10Xgenomics 單細胞轉錄組測序， Illumina HISEQ 4000
實驗設計：
實驗對象 | 例數（例） | 總細胞數（個） |
腎母瘤細胞 | 3 | 72501 |
透明腎細胞癌(ccRCC) | 3 | |
乳頭狀腎細胞癌(pRCC) | 1 | |
健康胎兒 | 2 | |
兒童 | 3 | |
青少年 | 2 | |
成人 | 5 | |
輸尿管 | 4 |
研究結果
3.1微滴質量控制和細胞單元分配概述
將得到的125139個unique barcodes的細胞通過質量控制，去除含有少于200個genes，線粒體基因表達超過20%細胞和利用標記組合檢測可能是相同亞群的細胞后得到72501個細胞，進一步將72501個胎兒、正常和腫瘤細胞分成免疫和非免疫細胞室（圖1）。
圖1
3.2 正常人腎的典型細胞類型
非免疫細胞中，在42809個非惡性細胞中，37951個成熟腎細胞代表腎單位不同顯微解剖區域的上皮細胞，t-SNE非線性聚類的方法和已知細胞標記基因展示其中近端小管細胞占很大比例(圖2，A～C)。此外，還有成纖維細胞、肌成纖維細胞和血管內皮細胞(腎小球內皮和上升和下降的直腸血管)(圖2D)
圖2
3.3 胎兒細胞類型與腎臟發生
同樣t-SNE非線性聚類的方法顯示胎兒細胞（4858個）分為發育期腎單位[輸尿管芽（UB）、帽間質細胞（CM）和原始囊泡（PV）細胞]和成纖維細胞、肌成纖維細胞、血管內皮細胞和神經節細胞（圖3，A至C）。細胞類群中腎發生基因的表達闡明腎單位的發育。腎單位的形成是從UB產生的，它導致上面的間質凝結成CM。然后CM形成PV即腎小球的前體。管狀系統從胎兒腎單位的UB和PV兩端生長。為了確定腎臟發生的轉錄程序，本文鑒定了在UB細胞對應CM和PV細胞中差異表達的轉錄因子，結果顯示轉錄因子的表達在偽時間軌跡上顯著變化（圖3D）。這些分析確定了與腎單位發育相關的已建立的和先前未知的轉錄因子，包括為隨后惡性腫瘤分析提供參考。
圖3
3.4 兒童腫瘤細胞與正常胚胎細胞比對分析
建立起健康腎的單細胞全景后，對來自腫瘤的6333個非免疫細胞和17821個免疫細胞進行研究（Wilms tumor, ccRCC, and pRCC)。結合基因分型和相似性分析，本文研究發現腎母細胞與正常胎兒細胞相似，來自腫瘤的肌成纖維細胞與來自成熟腎臟和胎兒腎臟的肌成纖維細胞相似性高，表明腎母細胞代表異常胎兒細胞，。與UB和PV細胞比對發現了差異的腎母癌細胞群（特定發育中的腎單位亞群）（圖4A）。為了驗證腎母癌細胞的細胞身份，本文對124個腎母癌細胞的一個獨立系列進行轉錄組查詢從而找到UB和PV的細胞特征，提取了在腎母癌細胞的UB或PV細胞中表達和在非腫瘤細胞中未表達的特異性標記，證實這些細胞在腎母腫瘤中的存在，PV和UB細胞的特征可見于腎母腫瘤和正常胎兒組織，并且局限于腎母腫瘤和正常胎兒組織（圖4B）。腎母腫瘤細胞的偽時間發育顯示出來自UB的兩個轉錄程序：一個分支主要描述腎源性剩余細胞的發育，另一個分支主要描述腎母癌細胞的發育（圖4C）。這兩個程序中的轉錄因子（圖4D）和正常腎形成的轉錄因子顯著重疊（P＜10-4；超幾何檢驗），這表明腎母癌細胞的發育來自于正常腎形成過程。該研究揭示了腎母細胞的可塑性并且來源于胎兒細胞的身份并且從轉錄水平上定義了發育細胞狀態和軌跡，這些狀態和軌跡可能具有可靶向的脆弱性。
圖4
3.5成人腫瘤與正常成熟腎細胞相匹配
接下來本文研究了ccRCC和pRCC（類型1）。將ccRCC和pRCC與正常成熟細胞匹配，發現它們保留了PT1細胞亞群的轉錄特征， PT1細胞亞群是卷曲近端管狀細胞的一種特殊亞型（圖5A）。為證實RCC中PT1標記物的身份，利用觀察結果，即PT1細胞是由SLC17A3和VCAM1定義的，本文數據中沒有SLC7A13。VCAM1表達在腎小管近端PT1特異性表達（P<10_4；Mann-Whitney試驗）（圖5B）。共聚焦顯微鏡顯示VCAM1和SLC17A3在CA9+細胞中定位，CA9是ccRCC細胞的特異性標志物（圖5C）。從三個人組織檢測，確定了Ca9+ VCAM1+近端腎小管細胞亞群（圖5D）。這些觀察證實PT1細胞是ccRCC細胞最近的正常相關細胞。在ccRCC和pRCC中都存在PT1標記可能表明這些腫瘤分歧的命運的共同起源。
圖5
總結
通過識別腎癌細胞特定的相關的正常細胞，這項研究將我們對這些惡性腫瘤的理解超越了“非胎兒性”的概念或從近似的微解剖區域到精確的細胞、分子定量分辨率。該研究發現將兒童早期腎母細胞瘤的發病高峰描繪為胎兒腎臟發生的腐敗，與成熟腎臟中腎癌的終生發展形成對比。該研究提供了一個可擴展的實驗策略，用于確定人類癌細胞的身份。
參考文獻
Young M D, Mitchell T J, Braga F A V, et al. Single-cell transcriptomes from human kidneys reveal the cellular identity of renal tumors[J]. Science, 2018, 361(6402): 594-599.
