2018-10-12
前言
單細胞轉錄組測序，指的是以單個細胞為特定研究對象進行轉錄組測序，并對獲得的數據做生物信息學統計分析的方法。
10x Genomics推出的ChromiumTM是基于一套分子條形碼和微流控技術的分析系統，由儀器、試劑盒和信息學軟件組成，能全面對接Illumina測序儀。該系統對細胞數量選取靈活，可同時獲得1000-10000個細胞的表達信息， 根據基因表達數據實現細胞亞群分類與細胞群體間標記物篩選，是細胞群體檢測、細胞異質性以及細胞發育分化等研究的方法。
應用方向
10x Genomics單細胞應用廣泛，可應用的細胞類型有：生殖細胞、胚胎細胞、神經細胞、免疫細胞、腫瘤細胞、干細胞等。
研究方向
1 人類細胞圖譜構建
2 腫瘤異質性研究
3 干細胞發育分化
4 免疫方向研究
5 神經系統發育研究
6 腦發育研究
7 胚胎細胞發育研究
8 疾病分型
技術原理
u 10x Genomics儀器小巧，但功能強大，其技術核心是油滴包裹的凝膠珠（GEM），該系統有75萬種barcoded beads，每個bead上有40-80萬探針。Barcode（16bp），一個微珠只對應于一種Barcode，通過Barcode區分凝膠微珠。UMI（10bp），是一段隨機序列，也就是說每一個cDNA分子，都有自己的UMI序列, UMI的作用是為了區分哪些reads是來自于一個原始cDNA分子。
圖1
技術要點
1 通過微流體“雙十字”交叉系統用油滴將含Barcoded RT Primers的Gel Beads、細胞和反應試劑包裹成GEMs（Gel Bead in Emulsion），即油包水結構
2 GEMs形成后，細胞裂解，凝膠珠自動溶解釋放大量barcode序列，隨后mRNA逆轉錄產生帶有Barcode和UMI信息的cDNA
3 油滴破碎，cDNA為模板進行PCR擴增，然后進行cDNA打斷、加測序接頭P5及測序引物R1等傳統二代測序的建庫過程
4 測序后，得到每個細胞的轉錄組表達譜，Barcode標記細胞，UMI標記基因并記錄表達量
圖2（圖片來源：10x Genomics Chromium SingleCell3’Solution Application）
操作流程
組織或細胞 → 單細胞懸液制備 → 單細胞轉錄組建庫 → 二代測序 → 數據聚類分析 → 細胞亞群分類
樣本準備
細胞類型：新鮮單細胞懸浮液
質量要求：細胞活性90%以上（不含有Ca2+,Mg2+ ），濃度500-2000cell/μl，起始量大于105個
細胞運輸：細胞保存于凍存液中，利用干冰/液氮運送
信息分析
Cell RangerTM分析流程，是10x Genomics針對ChromiumTM單細胞轉錄組測序開發的完整分析流程，該流程能進行細胞聚類、差異基因篩選、差異基因功能分析和細胞發育分化軌跡分析（圖3、4、5、6）等。
分析流程
測序數據質量統計（比對基因組、基因表達定量）→ 細胞過濾與標準化→ 細胞亞群分類 → 差異基因篩選 → 差異基因功能分析（GO、KEGG）→ 標記基因篩選
圖3 細胞亞群分類 (Matthew et al, 2018)
圖4 已有標記基因或差異基因篩選(Matthew et al, 2018)
圖5 差異基因功能分析
圖6 細胞發育分化軌跡(Matthew et al, 2018)
技術優勢
高通量、短周期、低成本、適用范圍廣
一次可以測8個樣本，每個樣本最多可獲得10000個細胞轉錄組數據
每個樣本通道10分鐘內完成1000-10000個細胞制備
一個油珠包含2個細胞的幾率低（Low Doublet Rate）：0.8%/1000個細胞
單個細胞捕獲率高達65%，細胞基因表達獲取高效精準
周期短，快的一天內完成文庫構建
與傳統人工細胞分離方法相比，價格更優
對細胞類型和大小幾乎無限制，已成功應用于腫瘤細胞異質性研究、免疫細胞分型和疾病分型等領域
文獻總結
年份 | 期刊 | 影響因子 | 研究方向 |
2018.8 | Science | 31.853 | 人腎腫瘤細胞鑒定和組成識別 |
2018.2 | Cancer Research | 9.122 | 腫瘤內皮細胞 |
2017.12 | Nature Communications | 12.124 | 乳腺上皮細胞 |
2017.5 | Nature | 40.137 | 小腸干細胞 |
2017.4 | Nature Method | 25.062 | 外周血單核細胞 |
2016.12 | Cell | 30.409 | CRISPR與10x Genomics單細胞轉錄組結合 |
