2018-09-11
我們在前期通過一篇研究人體EccDNA（染色體外環(huán)狀DNA）的文章，介紹了什么是EccDNA與CircDNA-Seq，以及它的研究材料和研究內(nèi)容概況，這里我們來詳細展示一下這篇文章的研究流程與發(fā)現(xiàn)。
1、EccDNA提取與測序
根據(jù)芽殖酵母Circle-Seq EccDNA的方法優(yōu)化人體組織中真核生物EccDNA的純化。
注：T1-T16：肌肉組織樣本；B1-B16：血液樣本；B6A-D，B14A-D：為測試線粒體DNA去除步驟中內(nèi)切酶之間的差異。T2，T7深度測序以檢測測序飽和度。
2、EccDNA測序數(shù)據(jù)分析
3、EccDNA研究結(jié)果
EccDNA在健康的人體組織和血液中很常見，其大小足以攜帶一個或幾個完整的基因。我們發(fā)現(xiàn)EccDNA具有轉(zhuǎn)錄活性，認為EccDNA通過全長和/或基因片段的表達促使產(chǎn)生表型變異。主要結(jié)果如下：
3.1 基于Circle-Seq方法的EccDNA比對
總共檢測到來自肌肉樣本的43,460個hconf EccDNAs，81,066 個conf EccDNAs和13,655 lowq EccDNAs（每個樣本106個細胞核）。在白細胞中，總共檢測到6,253個hconf EccDNAs，3,191個conf EccDNAs和784個lowq EccDNAs（每個樣本104個細胞核）。有130個EccDNA被定位到0.3Mb的TTN基因。注：Reads覆蓋率＜95%被定義為低質(zhì)量（lowq），reads覆蓋率＞95%的EccDNA，相對于相等長度的相鄰區(qū)域的總覆蓋范圍，平均覆蓋率高于2倍的被定義為hconf，低于2倍的定義為conf。
3.2 質(zhì)粒和重復序列上的EccDNA大小與reads分布
從16個肌肉樣本中鑒定出138,027種不同的EccDNA。所有染色體均以EccDNA序列表示，其組合長度為人類基因組的12.6％（389.5 Mb）。使用在EccDNA純化之前添加到肌肉和血液樣品中的內(nèi)部質(zhì)粒對照測量Circle-Seq的靈敏度，Circle-Seq在每個細胞核的4kb范圍內(nèi)可檢測到1-250個EccDNA。
3.3 EccDNA斷裂點的基因組分布
大多數(shù)EccDNA（99％）小于25 kb，而剩余的1％來源于斷裂點則超過了25 kb。超過一半的EccDNA來自基因或假基因區(qū)域（血液55％，組織52％）。
3.4 EccDNA 驗證與DNA 缺失
通過Sanger測序驗證了所有測試的EccDNA中的85％（20個中的17個），特異EccDNA來自基因間和基因位點。例如，[ERBB2circle exon 1-7]，其中包括ERBB2的前七個內(nèi)含子和外顯子。另外在DAZ4基因中，在[DAZ4circle exon 18]形成的精確位點發(fā)現(xiàn)DNA缺失。在血液和肌肉樣品中，還檢測到來自經(jīng)常發(fā)生大量DNA缺失的基因位點的EccDNA，例如HLA（5 Mb，6p21.32-p22.1），KIR（1 Mb，19q13.42）和SERF1A_SMN2（2.5 Mb，5q13.2）。這些發(fā)現(xiàn)表明，大量DNA缺失可導致健康人體細胞中的EccDNA產(chǎn)生。
3.5 與染色體、基因密度和轉(zhuǎn)錄有關的EccDNA頻率
EccDNAs的基因組分布顯示，富含基因的17和19號染色體每Mb產(chǎn)生的EccDNA數(shù)目分別比其他染色體高出了1.7倍和2.9倍。另外，發(fā)現(xiàn)EccDNA/Mb與編碼基因/Mb的比率之間存在正向關系，該結(jié)果表明編碼基因的轉(zhuǎn)錄或其他特征影響了EccDNA形成的頻率。
3.6 來自[HIP1circle exon 1]的EccDNA的轉(zhuǎn)錄本
為了研究EccDNAs是否被轉(zhuǎn)錄，篩選了肌肉組織中的mRNA序列，這些序列可以與檢測到的EccDNA接合點的轉(zhuǎn)錄事件相匹配。從8名參與者的肌肉樣本中鑒定了25種不同EccDNA的接合點轉(zhuǎn)錄本。樣品中的EccDNA轉(zhuǎn)錄本證實了EccDNA的存在，例如，在五個參與者中，我們檢測到TTN基因的分離轉(zhuǎn)錄reads，其與檢測到的[TTNcircle]坐標匹配，其中一個大小為612,228bp。檢測到T8樣品中18kb [HIP1circle exon 1]的EccDNA坐標與來自T8的Huntington interacting protein 1的第一外顯子的mRNA轉(zhuǎn)錄之間的完美重疊。
參考文獻：
Henrik Devitt M?ller, Marghoob Mohiyuddin, I?igo Prada-Luengo, M. Reza Sailani, Jens Frey Halling et al. Circular DNA elements of chromosomal origin are common in healthy human somatic tissue[J]. Nature Communications, 2018, 9: 1069.
2018/9/11
轉(zhuǎn)錄調(diào)控事業(yè)
