2018-06-11
第三代測序技術是指單分子測序技術。與二代測序相比，三代測序不需要經過PCR擴增，實現了對每一條DNA分子的單獨測序。由此可見，不依賴于PCR的三代測序對原始投入DNA的質量和總量要求是很高的。另外，第三代測序還可以進行全長16s/18s測序、擴增子和全長轉錄組測序。當然，三代測序平臺還可以做其他很多事情，在此就不一一贅述啦！
為了解決老師對三代基因組、多樣性和全長轉錄組測序樣本和DNA或者RNA相關要求的疑問，方便實驗的展開，我們專門總結了常見樣本和核酸的送樣要求以及標準。對于一些沒有提及到的樣本類型可以咨詢我們的銷售哦~
基因組測序樣本主要包括原樣和DNA兩種類型。原樣主要有微生物（細菌和真菌）、動物組織、血液樣本、植物組織等。一般情況下，只需要滿足下列要求就可以啦!
微生物菌體（適用于細菌、酵母菌和霉菌等）
培養情況
對數期
常規菌體： OD600 = 0.4~0.8
多糖或次生代謝物較多的菌體： OD600 = 0.4~0.6
菌體收集
離心收集
離心條件： 溫度為 4℃， 轉速 ≤ 10000 rpm/min， 時間 ≤10 min
菌體洗滌
離心倒掉培養基后，用 1x PBS 緩沖液清洗1-3次（培養基要洗干凈），然后離心收集菌體，棄盡緩沖液，隨后迅速置液氮冷凍，-80℃保存，干冰運輸
動物組織
動物組織建議選擇核酸含量較高、成分簡單且容易研磨的部位，比如肌肉組織。不建議送骨、角、殼和毛發等核酸含量少且不易研磨提取的部位。以下是取樣建議：
新鮮的組織
組織取下后應迅速置液氮冷凍，-80℃保存，干冰運輸
避免反復凍融
植物組織
植物組織主要分為根、莖、葉、花、果實和種子等。相信大家都傾向于送葉片吧！一般情況下，幼葉所含的次生代謝產物（含氮有機物、萜類化合物和酚類化合物）相對較少，相對莖、種子和果實等其他部位所含DNA量更多，提取起來更加容易成功! 以下是一些取樣建議：
幼葉或者嫩葉
葉片表面無水分和可見雜質
葉片取下后應迅速置液氮中冷凍，-80℃保存，干冰運輸
避免反復凍融
血液樣本
采集新鮮的血液于含有EDTA的抗凝管中，
常溫3000rpm/min 離心15min，棄掉上層血漿，
將下層血細胞分裝到EP管中，迅速放置-80℃冷凍保存，干冰運輸
避免反復凍融
下面要關心的問題是送多少合適？送一火車？沒必要，請看下表：
物種名 | 正常一次提取需要的量 |
革蘭氏陰性細菌 | 菌體濕重1.5g |
革蘭氏陽性細菌 | 菌體濕重2g |
植物組織 | 嫩葉鮮重5g |
小型真菌 | 菌體、菌絲和孢子粉等 濕重2.5g |
大型動物 | 肌肉組織鮮重5g |
小型動物 | 動物體累計鮮重3g |
昆蟲 | 正常體型3g |
血液（抗凝） | 哺乳動物血液10ml,非哺乳動物血液5ml |
… | … |
為保證實驗能短時高質完成，我們建議老師送三次提取的用量~
以上就是基因組測序取樣的主要注意事項啦！話說，取樣完了就該送樣了~其實吧，送樣比較簡單，一般情況下，準備足夠大的泡沫箱（隔熱效果好）和足夠量的干冰，一把剪刀一卷膠帶就好啦!要保證運輸過程中干冰別蒸發完了（多加點干冰并且密封好）！
原樣說完了，簡單說一下送樣為DNA的一些要求
1. 總量：20K文庫需要60μg，40K文庫需要200μg（由于收到DNA溶液后我們會進行磁珠純化提高純度，根據DNA溶液的純凈度會有20-80%的損耗，DNA里面雜質越多損耗越大，總量是否合格需根據純化后的結果判定）
2. OD值：260/280=1.8-2.0， 260/230=2.0-2.2；
3. 紫外濃度/熒光濃度<2；
4. DNA完整度：無降解，主帶>50kb；
5. DNA樣本溶于Buffer EB中（QIAGEN, 250 ml Elution Buffer 貨號：19086）；
6. 電泳檢測無RNA污染；
7. 物理化學性質正常，即DNA溶液為無色、透明、不粘稠和無熒光染料的液體狀態；
8. 避免紫外照射，不可反復凍融，不可存放于高溫狀態，不可存放于極端PH溶液中（PH<6或PH>9）
以上是基因組測序的送樣要求，接下來我們要聊聊多樣性的送樣要求啦，篇幅較長，但都是知識點，請各位老師耐心閱讀~
樣本獲取及制備（多樣性篇）
原樣類
糞便樣品
取樣時避免尿液和水體污染，用糞便取樣勺等截取糞便樣品中段里部（糞便表層含有腸粘膜脫落細胞，外部容易污染，且接觸空氣后，部分細菌DNA開始降解），保存在無菌的2.0ml離心管中，每管0.5-1.0g樣品，每個送三份，并做好標記，-20℃冰箱凍存，足量冰袋運輸。
腸道內容物
取出整個腸道，切取所需腸道內容物（有條件的可以在超凈工作臺中操作），用無菌手術刀刮取或者鑷子擠出內容物，保存在無菌的2.0ml離心管中，每管0.5-1.0g樣品，每個送三份，并做好標記，-20℃冰箱凍存，足量冰袋運輸。
土壤樣本
挖取地下5-20cm的土層，去除可見雜質，保存在無菌的2.0ml離心管中或者小自封袋中，每份0.5-1.0g樣品，每個送三份，并做好標記，-20℃冰箱凍存，足量冰袋運輸
水體樣本
將水樣通過濾膜進行過濾，過濾后微生物會截留在濾膜上，用0.45μm孔徑的濾膜，富集真菌類或者體積更大的生物，用0.22μm孔徑的濾膜，富集細菌或者體積更大的生物。每個樣本過濾出三份濾膜并做好標記，-20℃冰箱凍存，足量冰袋運輸。
DNA 檢測樣品
1. 基因組DNA
1） 體積大于20μl
2） DNA樣本溶于buffer EB（QIAGEN,250ml Elution Buffer 貨號：19086）。
3） 電泳檢測無RNA 污染
4） 由于微生物樣本的特殊性，樣品是否合格，以最終擴增結果為準。
2. PCR產物
1） 體積大于20μl，濃度大于10ng/ul
2） 條帶單一，無非特異雜帶
3） 凝膠電泳時不能使用EB（溴化乙錠），建議使用SYBR ?Safe DNA Gel Stain （Invitrogen ，貨號：19086）
4） 不能太長時間暴露在紫外線下
5） 回收好的PCR產物溶于buffer EB（QIAGEN,250ml Elution Buffer 貨號：19086）
6） 物化狀態正常：樣品無色，透明，純凈無雜質不粘稠，無熒光染料等污染
7） 避免紫外照射，避免反復凍融和高溫存放，避免存放在偏酸或者偏堿溶液中（PH<6或者PH>9）。
最后就是全長轉錄組的送樣要求啦，詳細如下~
樣本獲取及制備（轉錄組篇）
全長轉錄組測序送樣也主要包括原樣和RNA兩種類型，由于我們身邊的RNA酶太豐富了，且性質十分穩定，不容易被破壞，因此RNA的取樣需要更注意一些細節。
I取樣實驗前處理
1. 組織取樣部位要正確，并剔除與研究無關組織部位的影響，爭取實驗組和對照組的取材時間，部位等方面保持一致；
2. 保證取樣的過程和使用的器械，容器，試劑均沒有RNA酶污染；
3. 實驗前分別用酒精和蘸RNAzap的無紡布擦拭工作臺面，需要用的器械等，這一步很重要呦；
4. 實驗全程需佩戴一次性口罩和乳膠手套，實驗過程中勤換手套。
II取樣實驗（已經取好的樣品切忌反復凍融）
動物組織
解剖活體特定組織樣本2g，用無酶水（每取樣一個換一次，避免污染）快速涮干凈表面血液（動作迅速），放入無RNase離心管（建議用專門的凍存管）中，擰緊蓋子，放入液氮中冷凍15分鐘，取出離心管放入寫好樣品信息的自封袋中，放在-80℃冰箱保存，干冰運輸。
該送樣要求適用于多數RNA豐度較高的組織，針對豐度較低的組織需要加大送樣量，具體組織RNA豐度見下圖（供參考）
細胞
貼壁細胞：在顯微鏡確認細胞的完整性（破裂細胞會釋放RNA酶降解RNA）,使用預冷的1*PBS清洗貼壁細胞兩次，加入適量的TRIzol（Invitrogen 貨號：15596018），使用移液器充分吹打使細胞裂解，將細胞裂解液轉移至1.5ml無酶管中，-80℃保存，干冰運輸。
懸浮細胞：選取生長對數期的細胞懸液，200g離心5min，去上清，加入適量1*PBS清洗兩次，加入適量的TRIzol（Invitrogen 貨號：15596018），使用移液器充分吹打使細胞裂解，將細胞裂解液轉移至1.5ml無酶管中，-80℃保存，干冰運輸。
細胞總量要求：5-10×107個，請提供三次所需用量。
血液（切忌反復凍融，取樣到樣品提取最好不要超過15天）
全血：取新鮮血液1ml于含EDTA的抗凝管中，混勻，用移液器分裝到無酶的1.5ml離心管中，每管250ul，加入750ul TRIzol LS（Invitrogen 貨號：10296010），混勻，液氮冷凍15min，-80℃冰箱保存，干冰運輸。
血漿：將使用抗凝管所得的血漿分裝入1.5ml的離心管中，每管1ml，液氮冷凍15min，-80℃冰箱保存，干冰運輸。
總量要求：請提供三次所需用量
植物組織
盡量選取植物新鮮，幼嫩，生長旺盛的組織部位2g，擦凈表面灰塵和雜質，迅速放入已經寫好編號的螺紋凍存管中，液氮冷凍15min，-80℃冰箱保存，干冰運輸。
細菌，真菌
取2ml對數期的菌液于無酶管中，4℃，1000rpm，2min，去除上清，（菌體過老或培養基殘留會嚴重影響提取結果），液氮冷凍15min，-80℃冰箱保存，干冰運輸（有毒性、致病性和傳染性的樣品千萬不要寄送哦~）。
RNA樣品
RNA樣品需裝在無酶的1.5ml離心管中，物化狀態正常：無色，透明，純凈無雜質的液體。濃度＞300ng/ul，總量大于5ug（單次建庫所需用量），請準備三次所需量，2100檢測RIN值≥8.0，RNA檢測結果(是否符合后續實驗)以實驗室實驗報告為準。
以上就是這次介紹的所有內容啦，期待下次再見~
