2018-05-16
在前兩期的微信文章中，我們?yōu)榇蠹谊懤m(xù)分享了BSA類型、基本原理、樣本選擇等一大波干貨，相信通過這些大家也都了解到BSA分析其實只是一個初定位結(jié)果，后續(xù)還有大量的驗證工作在等著你哦！不過究竟做哪些驗證才能讓我們與一篇華麗的SCI更近一步呢？別著急，今天小編為大家?guī)韮善饰恼拢匆豢碆SA的故事要怎么講，才能更加栩栩如生！（文章后附精彩點評哦）
1. QTL Mapping by Whole Genome Re-sequencing and Analysis of Candidate Genes for Nitrogen Use Efficiency in Rice
研究背景
氮素是影響水稻生產(chǎn)的關(guān)鍵營養(yǎng)元素，植物缺氮會導致葉片黃化，植株矮小，糧食產(chǎn)量降低等問題，而氮肥使用過多又會導致嚴重的環(huán)境污染。培育具有良好氮利用效率的優(yōu)質(zhì)水稻品種對于農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。研究表明，氮利用率（nitrogen use efficiency, NUE）是一個由多基因和微效QTLs控制的數(shù)量性狀。本研究旨在聯(lián)合混池分析（BSA）和全基因組重測序法鑒定水稻NUE關(guān)鍵位點。
材料與方法：
首先，由精英水稻GH998和野生稻Y11繁殖多代得到近等基因系NILs（BC4F6），然后從中挑選氮利用率較低的NIL-13B4與GH998（高NUE）雜交得到F1，F(xiàn)1自交得到F2代（280個），選取極端性狀的個體各30個分別構(gòu)建混池，測序深度30x，兩個親本分別測20x，測序平為 Illumina HiSeq2500。
研究結(jié)果：
QTL-seq 鑒定NUE相關(guān)基因
通過計算高、低NUE兩個混池的基因型頻率，利用detla SNP index法將水稻NUE QTL位點定位到Chr6 6,099,043-8,940,631 bp之間（95%置信水平，圖1），并將其命名為qNUE6。為了核實qNUE6的有效性，通過 SSR分子標記結(jié)合樣本表型和基因分型數(shù)據(jù)，將QTL位點定位到marker RM539和RM136之間，然后利用11對有多態(tài)性的InDel標記將區(qū)間縮小到266.5kb。
圖1 SNP index圖
候選基因表達與進化分析
在266.5kb的區(qū)間種共有44個候選基因，其中39個基因具有較大效應的SNP和InDel支持。對其進行qRT-PCR驗證，結(jié)果顯示有28個基因能夠正常在根部和莖葉中表達，有兩個基因LOC_Os06g15370和LOC_Os06g15420在兩個親本中顯著差異表達（圖2）。LOC_Os06g15370編碼肽轉(zhuǎn)運蛋白（PTR2），與擬南芥葉綠體亞硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白AT1G68570有相同的PTR2 domain。同禾本科作物進行進化分析，發(fā)現(xiàn)LOC_Os06g15370與GRMZM2G361652（玉米亞硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白）和Sb10g009530（高粱亞硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白）的序列相似度分別高達86.2%和86.4%。
LOC_Os06g15420（OsAS2）編碼天冬氨酸合成酶（AS），研究表明，有NH4+供給時，在擬南芥的根部組織中可檢測到OsAS2的表達。而LOC_Os06g15420與擬南芥基因AT5G65010 (ASN2) 序列相似度為87.5%。
圖2 候選基因在GH998和Y11中的相對表達水平（1 mM NH3NO3處理48h后）
小編點評：這篇文章遵循的是典型QTL-seq套路，在初定位得到較大范圍的候選區(qū)域后，通過SSR和InDel分析標記法縮小區(qū)間，得到可接收數(shù)量的候選基因后利用qRT-PCR來驗證。這時再讓文獻、比對、結(jié)構(gòu)和進化分析等手段統(tǒng)統(tǒng)上陣，就可以基本推測出基因功能啦！
2．Identification of the dwarf gene GmDW1 in soybean (Glycine max L.) by combining mapping by sequencing and linkage analysis
研究背景
矮生植株因為能夠抗倒伏并且提高作物產(chǎn)量，是理想的育種材料。研究表明，在影響株高發(fā)育的各個因素中，赤霉素（GA）等植物激素發(fā)揮了重要的作用。本研究旨在通過混池測序和連鎖分析法對大豆突變株（dw）中的矮生基因位點進行鑒定并揭示相應的分子機制。
材料與方法：
大豆栽培品種Zhongpin661經(jīng)EMS誘變后得到矮生株（M3 line, DW），選擇含雜合DW位點的品系自交得到M4分離群體。分別提取45個野生型和突變型個體構(gòu)建混池，測序深度分別為50x和53x，插入片段長度為500bp，測序平臺為Illumina HiSeq 2500。根據(jù)歐式距離法（ED）計算兩個混池中等位基因頻率。
研究結(jié)果：
dw 突變株的表型和遺傳學特性
成熟的dw 突變株與野生型Zp661相比，主莖高度明顯下降（40%）且葉子顏色呈現(xiàn)暗綠色。主莖上的總節(jié)數(shù)無明顯變化，但節(jié)間長度顯著下降（60%）。掃描電鏡結(jié)果顯示細胞長度縱向下降而非細胞數(shù)目的減少是導致dw植株矮小的主要原因（圖1）。
dw 突變株與株高正常的3個大豆品種（Zp661、JD12和Zh13）雜交，F(xiàn)1所有個體均表現(xiàn)為正常株高，在F2群體中高矮植株分離比全部符合3:1，這表明dw突變是由隱性單基因控制的。
圖1 大豆dw突變株的表型特征
矮生突變株GA合成通路受阻
植物生長激素實驗結(jié)果顯示0-1mg/L GA3能促進dw突變株莖間組織的延長，使突變株表型恢復正常（圖1 a, b），而BR和IAA則沒有該效果。而當用GA合成抑制劑—烯效唑（Uni）處理時，野生型與突變型相比植株高度下降更多（圖1 c, d）。通過GC-MS測定野生株和突變株的內(nèi)源GA含量，發(fā)現(xiàn)GA1、GA4及前體GA12、GA19和GA24在野生株中均可檢測到，但在突變株中僅能檢測到GA24（圖1 e），這表明dw突變表型的產(chǎn)生與GA含量下降相關(guān)。
圖2 突變株GA合成受阻
GmDW1基因mapping與精確定位
通過與參考基因組Williams 82進行比對，在突變型和野生型混池中鑒定到47,535個個高質(zhì)量的 SNPs用于分析。以ED值高于0.259作為閾值，共得到6個可能的候選區(qū)間（表5），其中僅有3個區(qū)間存在非同義突變位點。同時，利用567個SSR標記通過連鎖分析將GmDW1 mapping到Chr8 6.7M區(qū)間。然后結(jié)合SSR 和SNP標記的基因分型結(jié)果縮小到 SNP08-1和08-0716（SSR）之間的460kb區(qū)域，該區(qū)域僅有2個SNP能引起外顯子區(qū)的非同義突變，對應的基因分別是GmDW1和Glyma.08G165100。功能注釋結(jié)果顯示，GmDW1編碼大豆的KS酶，推測可能是導致植株矮小的關(guān)鍵基因。
表5 基因組混測測序mapping 矮生表型相關(guān)基因
小編點評：這篇文章在Mutmap+的基礎(chǔ)上與連鎖mapping相互結(jié)合，綜合兩者得到的overlap進一步分析候選區(qū)間，SSR、InDel、SNP標記無一例外，全部用于基因的精確定位。另外，非常值得一提的是人家的表型工作鑒定的非常全面，一點都不局限于表面，連SEM都用上了，并且深入研究了dw突變株矮小的原因——赤霉素合成通路受阻。
參考文獻：
1. Yang et al. QTL Mapping by Whole Genome Re-sequencing and Analysis of Candidate Genes for Nitrogen Use Efficiency in Rice.[J] .Front Plant Sci, 2017, 8: 1634.
2. Li et al. Identification of the dwarf gene GmDW1 in soybean (Glycine max L.) by combining mapping-by-sequencing and linkage analysis.[J] .Theor. Appl. Genet., 2018, 131(5): 1001-1016.
