2018-02-28
研究背景
丹參是一種傳統的中藥植物，它的根對于高血脂、腦血管和心血管疾病有很好的療效。目前，隨著環境條件日益惡劣，尤其是全球變暖帶來的干旱氣候，造成丹參種植范圍的縮小和產量的嚴重下降。因此，提高丹參適應脅迫尤其是干旱脅迫的能力有著非常重要的實際價值。但是，目前通過基因工程改造丹參的研究方向主要聚焦在提高其藥用活性成分（如丹參酮）的含量，幾乎沒有研究應用基因工程來改善丹參適應脅迫的能力。本研究通過在丹參中異源表達擬南芥的DREBs來改善其抗旱性，并通過表型觀察和生理學研究、轉錄組測序分析解析相關抗旱分子機制。
材料與方法
1、 實驗材料：
分別選取3株干旱處理6天的51天大小的丹參：p35S::AtDREB1C（組成性啟動子CaMV35S驅動擬南芥基因AtDREB1C表達的轉基因丹參）、pRD29A::AtDREB1C（脅迫誘導RD29A啟動子驅動擬南芥基因AtDREB1C表達的轉基因丹參）和WT（野生型丹參），提取RNA，等量混合后構建cDNA文庫進行轉錄組測序。
2、測序方法及數據量：
RNA Seq：Illunima Hiseq 2500 platform，每個樣品約5G數據量。
研究結果
1、 構建轉基因植物
為了研究擬南芥基因AtDREB1C在丹參中的作用，構建了兩種轉基因丹參：p35S::AtDREB1C 和pRD29A::AtDREB1C。其中p35S::AtDREB1C是在組成性啟動子CaMV35S驅動下，而pRD29A::AtDREB1C則是在脅迫誘導RD29A啟動子驅動下。分別用PCR和RT-PCR對轉基因植物進行了驗證，從中分別篩選了4個轉基因line用于后續研究：p35S::AtDREB1C-01和04，pRD29A::AtDREB1C-02和07。
2、轉基因丹參中AtDREB1C表達模式
用RT-PCR方法檢測在外源ABA處理和各種脅迫處理條件下，轉基因丹參中AtDREB1C的表達情況。實驗結果顯示，無論是在對照組還是處理組，在p35S::AtDREB1C的兩個lines中，AtDREB1C都呈現出較高的表達量；而在pRD29A::AtDREB1C的兩個lines中，在對照組AtDREB1C表達量非常低，在處理組AtDREB1C受到很強的誘導表達。
3、轉基因丹參的表型變化和抗旱性分析
通過觀察在干旱處理條件下轉基因丹參和WT的表型，從而檢測在丹參中表達AtDREB1C是否能增強抗旱性。在干旱處理早期（處理3天），所有植物都表現出正常生長狀態。在干旱處理6天時，WT和轉基因對照植物的葉片迅速萎蔫，而轉基因丹參則沒有變化。在干旱處理9天時，WT和對照植物嚴重萎蔫，而轉基因丹參幾乎沒有變化。在干旱處理晚期（處理11天），所有的植物，包括轉基因丹參，都表現出嚴重的萎蔫。在恢復供水以后，轉基因丹參p35S::AtDREB1C和pRD29A::AtDREB1C都迅速恢復了，而WT和轉基因對照則不能恢復生長，最終死亡。
圖1 轉基因AtDREB1C丹參表型分析
4、異源表達AtDREB1C可降低干旱脅迫下ROS的積累
一般干旱脅迫會引起植物ROS的積累，因此分析在干旱脅迫下轉基因丹參是否可以減少ROS的積累。通過NBT和DAB染色方法檢測干旱脅迫下植物體內O2- 和H2O2。在正常生長條件下，WT和轉基因對照都沒有檢測到NBT染色，在干旱處理下，可以看到明顯的NBT染色。但是即使在干旱脅迫下，在AtDREB1C轉基因丹參中也沒有檢測到NBT染色。此外，相對WT和轉基因對照，AtDREB1C轉基因丹參中也沒有檢測到明顯的DAB染色。O2- 和H2O2的定量分析結果顯示，在AtDREB1C轉基因丹參中ROS含量顯著性低于WT。
圖2 WT和轉基因丹參葉片中O2- 和H2O2分析
5、表達AtDREB1C影響MDA含量和SOD、POD、CAT活性
我們還檢測了在WT和轉基因丹參葉片中一個脂質過氧化作用的標志物質MDA的含量。在干旱處理9天時，轉基因丹參中MDA含量明顯低于WT和轉基因對照。進一步通過檢測SOD、POD和CAT（清除脅迫時植物積累的有害ROS的抗氧化酶）的活性來分析轉基因丹參的抗旱機制。分析結果顯示，在9天干旱處理過程中，這些抗氧化酶的活性在各植物中趨勢類似。在AtDREB1C轉基因丹參中，所有抗氧化酶的活性都要顯著高于WT和轉基因對照。這些結果說明，AtDREB1C轉基因丹參的抗旱性增強可能與其減少的MDA含量和增強的抗氧化酶活性相關。
6、過表達AtDREB1C增加了轉基因丹參中RWC和葉綠體含量
我們檢測了干旱處理9天時植物體內的RWC和葉綠素含量。AtDREB1C轉基因丹參的RWC含量高于WT和轉基因對照，p35S::AtDREB1C和pRD29A::AtDREB1C之間沒有顯著差別。tDREB1C轉基因丹參的葉綠色含量也顯著高于WT和轉基因對照，p35S::AtDREB1C的葉綠色含量最高。
7、干旱脅迫下AtDREB1C轉基因丹參光合作用能力增強
為了評估轉基因丹參的光合作用能力，我們用CIRAS-2方法檢測干旱處理下植物的凈光合速率（Pn）、蒸騰速率（E）和葉片的氣孔導度（gs）。正常生長條件下，在所有材料中這些值均沒有顯著差異。在干旱處理下，WT和轉基因對照Pn、E和gs值都顯著下降，但是AtDREB1C轉基因丹參的受到的影響沒這么大。在干旱處理9天時，這些參數差異最顯著，但是p35S::AtDREB1C和pRD29A::AtDREB1C沒有顯著差別。
8、干旱脅迫下過表達AtDREB1C轉基因丹參轉錄組測序分析
為了進一步解析AtDREB1C轉基因丹參抗旱的分子機制，我們通過對p35S::AtDREB1C、pRD29A::AtDREB1C和WT進行轉錄組測序進而分析轉錄組基因表達變化。對p35S::AtDREB1C、pRD29A::AtDREB1C和WT，分別提取3株干旱處理6天的51天大小植物提取RNA，等量混合后構建cDNA文庫進行轉錄組測序。對轉錄組數據進行de novo組裝，得到13,153,489條contigs，161,844個轉錄本和73,748個unigenes。
通過對1,970個差異表達基因（DEGs）進行聚類分析發現，其中704個差異基因在兩個差異分組（WT vs p35S::AtDREB1C，WT vs pRD29A::AtDREB1C）中表達都類似。相對WT，在p35S::AtDREB1C中629個unigenes上調351個下調表達，在pRD29A::AtDREB1C中1,148上調378個下調表達。相對于p35S::AtDREB1C，在pRD29A::AtDREB1C中342上調101個下調表達。
圖3 WT和AtDREB1轉基因丹參的差異基因聚類分析
圖4 兩組差異分組（WT vs p35S::AtDREB1C WT vs pRD29A::AtDREB1C）韋恩圖
9、差異表達基因的COG富集和KEGG通路分析
通過對DEGs在COG數據庫進行注釋和分類分析，基于注釋在COG每個分類中的基因數目進行排名，發現在兩個差異分組的DEGs中，“轉錄本”和“信號轉導機制”都排在前三類中。這說明在這兩個分類中的差異基因在轉基因丹參抗旱中發揮重要作用。
我們還用KEGG數據庫對DEGs進行基因功能和調控通路分析。分別獲取了兩個差異分組（WT vs p35S::AtDREB1C，WT vs pRD29A::AtDREB1C）DEGsD的KEGG富集的前50個代謝通路。在兩組中均富集的KEGG通路有光合作用、
植物激素信號轉導、核糖體、苯丙素生物合成。其中植物激素調控途徑分別位于兩個差異分組KEGG富集結果的第二和第四。具體分析各植物激素途徑發現，生長素、赤霉素、油菜素內酯、茉莉酸和水楊酸的途徑中，兩個差異分組的DEGs均上調表達；乙烯途徑中的差異基因則表現出混合表達模式。
圖5 差異基因的COG和KEGG分類分析
此外，還分析了干旱處理下p35S::AtDREB1C和pRD29A::AtDREB1C的差異基因DEGs。根據COG數據庫注釋，約15%的DEGs為“次生代謝生物合成轉運和分解代謝”。KEGG富集結果顯示，“苯丙氨酸代謝”和“苯丙素生物合成”位于前兩位。相對于p35S::AtDREB1C，大多數DEGs在pRD29A::AtDREB1C中上調表達。
圖6 植物激素信號轉導相差異基因的KEGG通路分析
創新點
1、提高丹參適應脅迫尤其是干旱脅迫的能力有著非常重要的實際價值。
2、目前通過基因工程改造丹參的研究方向主要聚焦在提高其藥用活性成分（如丹參酮）的含量，幾乎沒有研究應用基因工程來改善丹參適應脅迫的能力。本研究通過在丹參中異源表達擬南芥的DREBs來改善其抗旱性。
3、表型數據豐富，文章分別從植物形態、ROS含量、MAD含量、清除ROS的酶（CAT等）、光合作用相關參數、RWC和葉綠體含量，分析比較了轉基因丹參和WT的抗旱性。
4、轉錄組數據分析緊密與抗旱的表型數據相結合，從DEGs的COG和KEGG注釋和富集分析的結果來解析轉基因丹參抗旱的分子機制。
參考文獻
Modulating AtDREB1C Expression Improves Drought Tolerance in Salvia miltiorrhiza[J].Frontiers in Plant Science，2017.
