對(duì)于土壤微生態(tài)系統(tǒng)而言，通過功能基因?qū)ξ⑸锶郝溥M(jìn)行擴(kuò)增子測(cè)序分析，是探討土壤微生態(tài)作用機(jī)制的常用方法。最近，派森諾生物再次與石河子大學(xué)合作，在《Science of the Total Environment》（影響因子4.900）上發(fā)表文章，揭示化學(xué)和有機(jī)肥料的使用對(duì)滴灌石灰土中N2O氣體排放和反硝化細(xì)菌群落的作用。
1 研究背景
N2O是一種強(qiáng)效的溫室氣體，破壞臭氧層。大氣層N2O的含量的增加很大程度上和農(nóng)業(yè)耕作方式相關(guān)。大約58%的人為N2O的排放來自于農(nóng)業(yè)，在2030年很可能會(huì)因?yàn)镹肥和動(dòng)物肥料的施用N2O含量提升35-60%。反硝化作用是形成N2O的主要生物地球化學(xué)途徑，這個(gè)過程被4種關(guān)鍵酶催化：硝酸還原酶（NAR），亞硝酸還原酶（NIR），一氧化氮還原酶（NOR）和一氧化二氮還原酶（NOS）。編碼NIR和NOS的基因往往會(huì)通過相應(yīng)的功能基因來分析反硝化菌群。
本文研究目的是為了確認(rèn)不同施肥方式引起的土壤參數(shù)變化和反硝化菌群之間的潛在聯(lián)系。以滴灌棉花產(chǎn)業(yè)系統(tǒng)中石灰土為材料，連續(xù)4年施用化學(xué)肥料或者化學(xué)肥料加有機(jī)肥，從而比較化學(xué)肥料和混合有化學(xué)肥料的有機(jī)肥料對(duì)N2O通量的影響，并探究有機(jī)肥混合化學(xué)肥料如何影響土壤反硝化細(xì)菌的豐度，群落組成結(jié)構(gòu)和多樣性，揭示N2O產(chǎn)生、反硝化細(xì)菌基因群落豐度和土壤物理化學(xué)性質(zhì)之間的關(guān)聯(lián)關(guān)系。
2 研究方法
測(cè)序技術(shù)：Roche 454 FLX平臺(tái)
測(cè)序模式：nirK、nirS和nosZ功能基因測(cè)序
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：
實(shí)驗(yàn)對(duì)象
| 處理方式 | 組名 | 樣品數(shù) |
滴灌石灰土 | 未施肥 | CK | 3 |
化學(xué)肥料施肥 | CF | 3 |
60% 化學(xué)肥料+牛糞 | COM | 3 |
60% 化學(xué)肥料+生物肥料 | CBF | 3 |
3、研究結(jié)果
3.1 土壤中N2O通量
數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，施肥方式顯著影響土壤中N2O的通量（圖1）。按照N2O平均通量逐漸下降的順序進(jìn)行排序發(fā)現(xiàn)：CF>COM>CBF>CK。土壤中N2O通量通常在灌溉施肥后的前3-4天增加，隨后就會(huì)減少。CF中平均最大N2O排放量比COM和CBF分別高了29.1%和40.1%。同時(shí)發(fā)現(xiàn)N2O通量在CF中比COM和CBF減少更快。結(jié)果表明N2O通量在施肥后急劇變化，有機(jī)改良劑降低了N2O排放的峰值，但是隨著時(shí)間推移會(huì)釋放更多N2O。
圖1 棉花種植期間不同施肥模式下N2O通量統(tǒng)計(jì)圖
3.2 累積的N2O排放和N2O排放系數(shù)
和未施肥組相比，CF,COM和CBF處理組中累積的N2O排放是顯著偏高的（圖2）。CF組中累積的N2O排放要比COM和CBF處理組高3.65%和8.29%。排放系數(shù)（EF）值在CBF中要明顯比CF和COM組中要小，表明生物肥料減緩?fù)寥乐蠳2O排放，但是會(huì)比有機(jī)肥排放的更多。
圖2 不同施肥模式下土壤N2O排放和N2O排放系數(shù)
3.3 反消化酶活性
施肥組相比CK組，明顯增強(qiáng)了NAR，NIR和HyR的活性（圖3）。其中，CBF組通常擁有最高的酶活性，而在CF組中是最低的酶活。CBF和COM組中NAR和NIR的活性更高，但是HyR活性沒有明顯區(qū)別。結(jié)果顯示有機(jī)肥，特別是添加生物肥料之后，可以增強(qiáng)反硝化酶的活性。
圖3 不同施肥模式下反硝化酶活性統(tǒng)計(jì)分析
3.4反硝化基因豐度
和未施肥組相比，三種施肥處理明顯增加了nirK基因的數(shù)量。CF組nirK拷貝數(shù)最高，比CBF組和COM組分別高36.5%和20.9%（圖4）。但是，CF組中nirS和nosZ的基因拷貝數(shù)并沒有發(fā)生顯著變化。結(jié)果顯示施肥處理對(duì)三種類型的反硝化基因的豐度有不同影響。另外發(fā)現(xiàn)，NIR是和nirS而不是nirK亞硝酸還原酶基因的豐度有密切關(guān)聯(lián)。
圖4 nirK-、nirS-和nosZ型反硝化菌群的豐度及NIR活性和nirS或者nirK拷貝數(shù)之間的關(guān)系
3.5 與土壤理化性質(zhì)的關(guān)系
冗余分析用來檢測(cè)之土壤理化性質(zhì)，反硝化細(xì)菌群落豐度和反硝化酶活性之間的相互關(guān)系（圖5）。順著軸1看CF及CK處理組，發(fā)現(xiàn)很大程度上和COM及CBF處理組分的很開。可以看出，反硝化菌群的豐度和SOC，NH4+，NO3-和WHC呈現(xiàn)正相關(guān)，和MBC/MBN，pH呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。NirS的豐度明顯和nirK和nosZ型硝酸鹽還原酶基因拷貝數(shù)成正相關(guān)。反硝化酶活性和NH4+，SOC，NO3-呈正相關(guān)，和pH，MBC/MBN是負(fù)相關(guān)。總之，結(jié)果表示NH4+，SOC，NO3-和土壤pH顯著影響反硝化酶活。還有，自動(dòng)線性建模表明nirS型反硝化菌群，土壤SOC，NO3-和pH是和土壤N2O的排放相關(guān)的主要影響因子（圖6）。
圖5 反硝化菌群豐度與反硝化酶活和土壤生態(tài)因子之間的冗余分析
圖6 自動(dòng)線性建模預(yù)測(cè)分析反硝化基因豐度的重要性和挑選影響N2O排放的土壤理化屬性
3.6 反硝化細(xì)菌群落的豐度和多樣性
四組樣本測(cè)序共獲得195,904條nirK序列，183,441條nirS序列和375,839條nirK序列。CBF組中序列數(shù)量最多，隨后是COF，CF和CK。施肥增加了反硝化細(xì)菌相關(guān)的OTUs的豐度（用chao1和Ace評(píng)估）。CBF中nirS和nosZ的豐度要高于其他施肥處理組，也顯著高于對(duì)照組。但是施肥并沒有顯著影響nirK的Simpson和Shannon指數(shù)。COM和CBF組中nirS和nosZ的α多樣性要高于CK和CF組。結(jié)果表明有機(jī)肥料結(jié)合化學(xué)肥料顯著增加了nirS和nosZ的多樣性，而不包括nirK的多樣性。
3.7 反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)（熱圖）
施肥方式顯著影響了反硝化細(xì)菌群落的基因型變化（圖7）。NirK型反硝化菌群組成在COM和CBF中是相似的，但是和CK和CF相比是有顯著差異的。同時(shí)nirS型反硝化菌群組成在COM和CBF中也是高度相似的，有著相同的優(yōu)勢(shì)OTUs。而且NosZ基因中也有相同趨勢(shì)，CK和CF組總nirS和nosZ型群落幾乎是重疊的。總之，有機(jī)肥料導(dǎo)致nirK，nirS和nosZ型反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生巨大變化。
圖7 相對(duì)豐度top30微生物屬聚類熱圖分析
4、總結(jié)
有機(jī)改良劑（例如牛糞和生物肥料）的施用，減少了累積N2O的排放，降低了排放系數(shù)，同時(shí)增加了反硝化酶活性。研究結(jié)果表明，土壤中N2O的排放主要是和nirS型反硝化細(xì)菌的豐度、土壤有機(jī)碳（SOC）和NO3-相關(guān)，而反硝化細(xì)菌群落的變化和SOC、NO3-、NH4+、持水力和土壤pH密切相關(guān)。總之，有機(jī)肥料增強(qiáng)了反消化酶活性，增加了反硝化細(xì)菌基因的拷貝數(shù)，但是減少了N2O的排放，同時(shí)發(fā)現(xiàn)nirS和nosZ型反硝化細(xì)菌群比nirK型反硝化細(xì)菌群對(duì)有機(jī)肥料更敏感。
本研究亮點(diǎn)：
1、NirS和nosZ菌群不受化學(xué)肥料而受有機(jī)肥料的影響；
2、SOC、NO3-、NH4+和pH是促進(jìn)反硝化細(xì)菌群落豐度發(fā)生變化的主要影響因子；
3、影響N2O排放的重要因素是nirS菌群、SOC和硝酸鹽；
4、生物肥料和有機(jī)肥料同時(shí)使用可以顯著降低N2O的排放。
參考文獻(xiàn)
Tao R, Wakelin S A, Liang Y, et al. Nitrous oxide emission and denitrifier communities in drip-irrigated calcareous soil as affected by chemical and organic fertilizers [J]. Science of the Total Environment, 2018, 612:739.
原文鏈接：
http://dx.doi.org/10.1016/j.scitotenv.2017.08.258
