番茄（Solanum lycopersicum）是研究果實(shí)生物學(xué)的既定模型；然而，大多數(shù)對(duì)番茄果實(shí)生長(zhǎng)和成熟的研究都是基于均質(zhì)果皮，而不考慮個(gè)體細(xì)胞和組織類型的內(nèi)部組織或表達(dá)特征。使用激光顯微切割（LM）或手分離和RNA-Seq分析，作者提出了一個(gè)番茄果子個(gè)體發(fā)生學(xué)上的時(shí)空解決轉(zhuǎn)錄組分析。監(jiān)管和結(jié)構(gòu)基因網(wǎng)絡(luò)，包括轉(zhuǎn)錄因子家族和激素合成和信號(hào)傳導(dǎo)途徑，定義在組織和發(fā)育光譜。成熟程序揭示為包括基因表達(dá)的梯度，在內(nèi)部組織中開始然后向外輻射，并沿著緯度軸向基本上。作者還確定了疊加在成熟梯度上的表觀遺傳控制模式的空間變化。功能研究闡明了先前掩蓋的調(diào)控現(xiàn)象和關(guān)系，包括與果實(shí)品質(zhì)性狀（如質(zhì)地，顏色，香氣和代謝物特征）相關(guān)的現(xiàn)象。
實(shí)驗(yàn)材料：在開花期（DPA）受精后的5，10，20或30天時(shí)收獲膨脹的果實(shí)。成熟期和成熟的果實(shí)MG階段（全尺寸綠色果實(shí)，約39 DPA），Br階段（約42 DPA，確定打破從綠色到黃褐色，表面少于10％），Pk階段（50％粉紅色或紅色，大約Br + 2天），淡紅色（LR）階段（100％光照）紅色，約Br + 4天），紅色成熟（RR）階段（約Br+8天全紅）。每天在同一時(shí)間從60個(gè)隨機(jī)選擇的單株上收集子房和果實(shí)樣品。通過使用激光顯微切割（LM）或手分離的方法獲得六個(gè)主要的果實(shí)組織，包括果皮，隔膜，周圍組織，胎盤，小柱，以及種子（這里分類為組織型）。
測(cè)序平臺(tái)：Illumina HiSeq2500
基于組織或細(xì)胞類型的發(fā)育中番茄果實(shí)的RNA-Seq。
通過來自六種主要果實(shí)組織（圖1a）和五種果皮細(xì)胞/組織類型的LM衍生的或手工解剖的樣品的RNA測(cè)序（RNA-Seq）產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，共同跨越10個(gè)發(fā)育階段的果實(shí)赤道地區(qū)（圖1c）。果實(shí)組織在早熟和早熟期也分離自不同的緯度部分：在后者中，果皮端部的果皮中可觀察到與成熟相關(guān)的顏色變化（圖1d）。
圖1 進(jìn)行RNA測(cè)序的番茄組織及細(xì)胞材料
對(duì)來自總共483個(gè)樣品的RNA-Seq數(shù)據(jù)進(jìn)行總結(jié)。在6個(gè)果實(shí)組織和5個(gè)果皮LM樣品中，在發(fā)育過程中的某一點(diǎn)至少有一種組織/細(xì)胞類型分別表達(dá)了24506和20732個(gè)基因（平均RPM≥1），但通常在果實(shí)膨大期間檢測(cè)到更多（圖2），幾乎一半的基因在六種果實(shí)組織（10328個(gè)基因；42％）或五種果皮細(xì)胞/組織類型（9842基因；47％）。相反，相對(duì)較少的基因在整個(gè)發(fā)育過程中表現(xiàn)出組織/細(xì)胞特異性表達(dá)：在組織樣品中的最大亞組（1189；4.9％）和果皮細(xì)胞/組織類型中的維管組織中（950；4.7％）（圖3）。這與種子內(nèi)組織的高度分化和功能特化以及形成血管組織的多種不同細(xì)胞類型一致。
圖2 果實(shí)組織/細(xì)胞類型表達(dá)基因數(shù)目
圖3 果實(shí)組織/細(xì)胞類型中表達(dá)基因的分布
在解剖的果皮細(xì)胞/組織樣品中表達(dá)的20732個(gè)基因中，在總果皮樣品中也檢測(cè)到19494個(gè)，這意味著在總果皮樣品中未鑒定到1238個(gè)基因（6.4％）。僅通過LM檢測(cè)到的這1238個(gè)基因的表達(dá)水平相對(duì)較低（圖4a）。在總果皮中檢測(cè)到的19494個(gè)基因中，總共只有5.0％（從長(zhǎng)角骨的0.2％到維管組織中的2.6％）顯示細(xì)胞或組織特異性表達(dá)（圖4b）。相反，僅通過LM檢測(cè)到的1238個(gè)基因中，64％顯示出空間特異性表達(dá)（從長(zhǎng)角骨的2.5％到維管組織中的35％；圖4c）。這些數(shù)據(jù)表明使用高分辨率轉(zhuǎn)錄組測(cè)序使我們能夠檢測(cè)在某些果皮細(xì)胞類型中僅以低量存在的轉(zhuǎn)錄物，并且在總果皮樣品中過度稀釋。
RNA-Seq的主成分分析（PCA）揭示了基于發(fā)育階段，對(duì)應(yīng)于果實(shí)赤道地區(qū)的組織或細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)錄譜的清晰聚類（圖5）。
圖4 通過LM確定的基因表達(dá)譜
圖5 6種果實(shí)組織和5種果皮組織/細(xì)胞的PCA分析
高分辨率的基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)與果實(shí)品質(zhì)性狀相關(guān)的基因的高分辨率轉(zhuǎn)錄分析。
使用全局轉(zhuǎn)錄本分析的共表達(dá)分析允許識(shí)別功能相關(guān)的基因網(wǎng)絡(luò)，而更高級(jí)的時(shí)空數(shù)據(jù)集應(yīng)該導(dǎo)致更嚴(yán)格定義的網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)。為了檢驗(yàn)這個(gè)想法，作者首先使用了一種指導(dǎo)基因的方法，并尋找與查爾酮合成酶基因SlCHS-2共表達(dá)的基因。SlCHS-2在外表皮細(xì)胞中表現(xiàn)出優(yōu)先表達(dá)，其在成熟開始后增加（圖6a）。在30DPA之后，在種子中也檢測(cè)到了SlCHS-2的表達(dá)（圖6b）。圖7展示了與SlCHS-2共同表達(dá)的前10個(gè)基因（SCC = 0.74-0.85）。
圖6 SlCHS-2在果皮細(xì)胞/組織類型和種子中的表達(dá)
圖7表達(dá)多維數(shù)據(jù)集展示SlCHS-2和共表達(dá)基因的表達(dá)
預(yù)測(cè)生長(zhǎng)素信號(hào)中的蛋白質(zhì)相互作用。
全球共表達(dá)數(shù)據(jù)也提供了一個(gè)機(jī)會(huì)來確定功能性蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用可能發(fā)生的條件，組織/細(xì)胞和發(fā)育階段。作者對(duì)不同的組織/細(xì)胞類型和發(fā)育階段進(jìn)行了21個(gè)ARF和24個(gè)Aux / IAA基因的成對(duì)表達(dá)分析3738。在所有的ARF-Aux / IAA組合中，SlARF4和SlIAA15之間的相關(guān)性最高（Pearson相關(guān)系數(shù)（PCC）= 0.78）。預(yù)測(cè)并證實(shí)大家族成員SlARF4和SlIAA15蛋白之間的相互作用，說明高分辨率時(shí)空表達(dá)信息如何促進(jìn)相互作用蛋白伙伴的預(yù)測(cè)和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。
圖8 生長(zhǎng)素信號(hào)相關(guān)的成對(duì)相關(guān)分?jǐn)?shù)熱圖
參考文獻(xiàn)：
Shinozaki Y, Nicolas P, Fernandez-PozoN,et al.High-resolutionspatiotemporal transcriptome mapping of tomato fruit development and ripening.Nat Commun. 2018 Jan 25;9(1):364.
