2018-01-17
期刊：Developmental and Comparative Immunology
影響因子：3.217
ROS（reactive oxygen species,ROS）是需氧細胞在代謝過程中產生的一系列活性氧簇。中、高濃度的ROS通過細胞氧化應激反應誘導細胞凋亡甚至導致其壞死。隨著自由基生物學研究的發展，研究者們逐漸認識到ROS 可雙向調控某些腫瘤細胞的凋亡和增殖，并發現了自由基與細胞信號轉導之間的內在關聯。它能使造血祖細胞分化，并在造血細胞的命運調控中發揮著重要的作用。在此篇文章的研究中，利用離子激流質子測序平臺（Ion Torrent Proton sequencing platform），對中華絨螯蟹的造血組織（HPT）和血細胞進行了轉錄組測序，尋找與造血功能相關的潛在的信號通路；篩查成熟血細胞的潛在的分子標記以及挖掘ROS在造血功能中的作用、分子基礎和調節機制。
實驗對象：中華絨螯蟹
實驗方法：
1) 對HTP和血細胞進行轉錄組測序和QPCR驗證
2) 對HTP和血細胞中的ROS進行測定
3) 對HTP細胞的吞噬能力進行流式檢測
4) 注射NAC和嗜水氣單胞菌后測定ROS和血細胞總數（THC）
實驗結果：
1. 通過對HTP和血細胞中的ROS比較和對HTP細胞的吞噬能力的研究，探索ROS在HTP細胞增殖和分化過程中的作用
圖1 ROS和吞噬作用的流式檢測結果
氧化還原系統在維持干細胞的自我更新和分化方面起著重要的作用。活性氧(ROS)是由氧代謝產生的，在許多過程中，如癌癥、心血管疾病和衰老，都被牽涉其中。越來越多的研究揭示了ROS在血液生成中重要的調節作用。HPT和血細胞中通過流式細胞儀均檢測到ROS陽性信號，但是HPT中ROS的陽性率明顯高于血細胞（如圖1A和1C）。HPT細胞對于直徑為2μm的乳膠微球的吞噬能力為8.2%（如圖1B）。HPT細胞具有吞噬細胞的能力被證明，這表明在成熟前，血細胞前體細胞可能發生了功能性分化。
2. 通過對HPT和血細胞轉錄組數據比較，研究血細胞生成機制和開發潛在的分子標記物
表1 轉錄組測序比對統計
表2 兩組中差異表達基因數目統計
圖2 HPT和血細胞GO注釋
圖3 差異表達基因富集分析
對HPT和血細胞進行轉錄組測序，得到如表1和表2所示數據。對測序后的數據進行GO注釋（圖2）HPT和血細胞比較，共有362個差異表達基因（圖3），其中301個在HPT中上調，61個在血細胞中上調。 這三百六十二種不同表達的基因，其中一些可能是HPT和血細胞的標志性分子。301個在HPT中上調的基因成功富集到50個KEGG信號通路上，例如嘌呤代謝，嘧啶代謝，賴氨酸生物合成，組氨酸代謝，花生四酸代謝，脂肪酸生物合成，檸檬酸循環(TCA循環)和氧化磷酸化等。61個在血細胞中上調的基因主要富集到了七個KEGG通路，其中一個是酪氨酸代謝途徑，這表明了在血細胞中有獨特的酚氧化酶激活系統。此次的轉錄組數據為進一步研究血細胞生成機制和開發潛在的分子標記物提供了資源。
圖4 HPT和血細胞32個差異表達基因QPCR分析
如圖4所示，HPT和血細胞32個差異表達基因可分為DNA、RNA和蛋白合成，細胞分裂，線粒體和能量代謝，酚氧化酶激活系統和其他五類。這一結果也符合造血干細胞在分裂和分化過程中需要大量的DNA、RNA和蛋白質。對這些基因進行QPCR驗證，結果和轉錄組測序結果一致。
3. 通過注射NAC探究ROS對HPT造血功能的影響
NAC是一種ROS清除劑，在NAC刺激12h和24h后，HPT細胞中ROS的含量等級明顯下降（圖5A）。使用CCK8方法檢測NAC注射24h后HPT細胞的細胞活力，圖5B中明顯可以看出NAC組細胞活力顯著下降，并且圖5C中可以看出注射NAC12h和24h后，血細胞總數明顯下降,表明NAC抑制HPT細胞增殖。
圖5 NAC對HPT細胞中ROS、細胞活力和THC的影響
圖6 注射生理鹽水，嗜水氣單胞菌以及嗜水氣單胞菌和NAC對THC的影響
為了進一步證明ROS和造血功能之間的關系，對120只中華絨螯蟹隨機分成3組，第一組注射生理鹽水，第二組注射嗜水氣單胞菌，第三組注射嗜水氣單胞菌和NAC，然后統計THC的值。圖6表明注射NAC可以抵消注射嗜水氣單胞菌導致的THC增加的效果，使其恢復正常值。總結就是：經NAC對ROS進行了清除后，HPT細胞的相對存活能力顯著降低，同時，紅細胞總數也減少。更重要的是，NAC可以顯著降低由細菌刺激引起的血細胞總數的增加。這些結果共同證明了ROS信號對血細胞釋放的重要性。
參考文獻：
Jia, Z., Wang, M., Wang, X., Wang, L., Qiu, L., & Song, L. Transcriptome sequencing reveals the involvement of reactive oxygen species in the hematopoiesis from Chinese mitten crab Eriocheir sinensis. Developmental & Comparative Immunology. doi: https://doi.org/10.1016/j.dci.2017.12.030
