2017-12-20
簡介
OsABF1是bZIP轉錄因子，使用雜合轉錄因子（HTF）的方法與轉錄因子激活劑VP64（ABF1V）或轉錄因子抑制劑4EAR（ABF1E）融合，過表達轉基因株系顯示出明顯不同的耐旱表型。通過對轉基因水稻品系進行染色質免疫沉淀測序（ChIP-seq）和RNA測序（RNA-seq）測定，確定OsABF1與含有ACGT核心基序的DNA序列結合。經過分析RNA測序和染色質免疫沉淀測序數據之間的重疊，鑒定了涉及干旱反應多個方面的242個OsABF1靶基因。過表達這些基因之一的COR413-TM1（其編碼推定的類囊體膜蛋白）導致耐旱表型，沒有明顯的副作用，在開發耐旱作物方面具有潛在的效用。
ChIP-seq：2組樣本（WT植物和ABF1V-1轉基因株系），4周齡水稻幼苗。
RNA-seq：4組樣本（WT植物、ABF1V-1和ABF1E-1轉基因株系、干旱處理的WT-D），4周齡水稻幼苗，其中WT-D組進行4小時PEG處理。
平臺：Illumina HiSeq 2000
1.通過分析ChIP-seq數據鑒定ABF1V結合位點
鑒定了3882個定位于啟動子或CDS區域的結合峰的基因，64.7％的OsABF1結合位點位于啟動子區域（圖1A）。TSS距離計算顯示TSS上游200bp內的締合位點的富集（圖1B）,對OsABF1結合序列的分析檢測到ACGTG（G / T）（C / A）共有序列的過度表達（圖2C）。
圖1 ChIP-seq ABF1V結合位點鑒定
2. RNA-seq的差異表達分析和聚類分析熱圖
差異表達分析顯示：ABF1E株系中上調和下調基因的數目分別是171和818，ABF1V株系中上調和下調基因的數目分別是1550和2255，WT-D中上調和下調基因的數目分別是3596和4089。為了找到與OsABF1 HTF轉基因系的異常表型相關的基因，將DEG分為七組。在ABF1V株系的1550個上調基因中，117個在ABF1E株系中下調；在WT-D中，這117個基因中超過75％也被上調。聚類分析表明ABF1E株系與WT分在一個組，但是ABF1V株系更接近WT-D。
圖2 RNA-seq差異表達分析熱圖
圖3 RNA-seq聚類分析熱圖
3. RNA-seq和ChIP-seq數據之間的Venn圖重疊分析
ChIP-seq得到的與ABF1V 關聯的3882個基因，通過Venn圖重疊分析發現在ABF1V株系和WT-D中有242個OsABF1結合基因被上調。這些基因被認為是OsABF1直接調控干旱脅迫下的候選靶基因。
圖4 RNA-seq和ChIP-seq重疊分析Venn圖
4. RNA-seq和ChIP-seq聚類分析及靶基因COR413-TM1的選定
聚類分析顯示與OsABF1相關而受干旱脅迫影響的基因都豐富了在與膜，運輸，氧化還原過程，代謝，轉錄因子活性，激酶活性，磷酸酶活性，應激反應有關的途徑中。根據轉錄本與富集的途徑的關系以及qRT-PCR和ChIP-qPCR，又選出了7個候選基因。這7個基因都在應激反應功能分類中高度富集，干旱條件下上調，在ABF1V株系上調，在ABF1E株系中下調。其中一個候選基因是OR413-TM1，被確認是OsABF1的直接靶基因，且其超表達實驗表現出耐旱表型。
圖5 RNA-seq和ChIP-seq聚類分析圖
參考文獻：
Zhang C,Li C, Liu J,Lv Y,Yu C,Li H,Zhao T,Liu B. The OsABF1 transcription factor improves drought tolerance by activating the transcription ofCOR413-TM1 in rice.J Exp Bot. 2017 Jul 20;68(16):4695-4707.
